单细胞测序在肿瘤基因检测中的研究进展

孙凤环， 陈 健 综述， 张 鹏 审校

(1. 同济大学医学院，上海 200092; 2. 同济大学附属上海市肺科医院胸外科，上海 200433)

随着现代医学技术的发展，肿瘤已经进入了个体化治疗阶段。肿瘤的基因组转录组和表观遗传特征在探究肿瘤的发生、转归和个体化治疗中起到了重要作用。诸多研究[1-7]表明肿瘤微环境在此过程中也发挥了重要作用，各种检查点抑制剂的使用显著提高了部分患者的生存[8]。利用单细胞测序可以解析各种肿瘤细胞及肿瘤微环境中其他细胞的特点，更精准地从分子层面阐释肿瘤发生、发展、转移和耐药的机制，提高肿瘤的诊断效率、预测肿瘤转归并提高个体化治疗水平。本文将对单细胞测序技术及近年来利用该技术探究肿瘤异质性、肿瘤微环境特征和耐药性等各方面的应用进行综述。

1 单细胞测序技术

单细胞测序(single-cell sequencing, SCS)是从单细胞水平揭示细胞基因组、转录组或表观遗传变化的技术，从不同角度揭示细胞在不同阶段的功能和特性，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。传统的测序方法是对大量的混合细胞进行测序，把大量混合细胞的遗传信息进行平均化，忽略了各种类型的细胞之间的区别。如MAP等通过全部外显子测序检测了原发性肺癌的4个不同区域的病灶，发现在不同肺叶的肺癌组织、同一肺叶的不同病灶的肺癌组织、同一肺叶同一病灶不同区域的肺癌组织的基因表达差异[9]。但该研究未能明确这些差异表达基因的细胞来源，很有可能忽略一些数量稀少细胞的表达特征。而SCS技术可以更明确细胞水平的异质性，有利于分析组织中数量较少细胞的遗传信息和异质性较大肿瘤的特征。

1.1 SCS的实现方法

实现SCS有2种方法： (1) 分离单个细胞并独立构建测序文库进行测序；(2) 给每个细胞加上独一无二的DNA序列，测序时，把携带相同标记序列(barcode)的片段视为来自同一个细胞，通过一次建库测得数百上千个单细胞的信息，见图1。DNA主要是通过一种经过改造的高效转座酶(transposase)Tn5来添加标记序列；mRNA只需要在poly T引物的5’端加入标记序列即可。为了一次能够捕获更多单细胞，目前最常用的解决方案是组合索引，即通过Tn5转座和PCR加2次标签[10-11]。

图1 单细胞测序的发生过程Fig.1 The process of single cell sequencingA： 箭头代表移动方向,整个反应体系包含： 细胞、磁珠、细胞裂解液、反应需要的酶、buffer及进行油包水的油滴。B： 黑色部分代表细胞标记序列，每个磁珠只有一种细胞标记序列,黄色部分代表独立分子标签(unique molecular indexing, UMI)，每个链上的UMI均不同，橘黄色部分代表来自细胞中的遗传物质

1.2 SCS技术种类

SCS主要包括单细胞基因组测序、单细胞转录组测序和单细胞表观遗传测序，从不同角度揭示了肿瘤微环境中不同细胞的特性。

1.2.1 单细胞基因组测序 单细胞基因组测序主要包括单细胞全基因组测序和单细胞全部外显子测序。主要用于鉴定单核苷酸变异、拷贝数变异(copy number variations, CNV)和染色体结构变异。

1.2.2 单细胞转录组测序 最常用的方法为单细胞全转录组测序，对单细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路分析。

1.2.3 单细胞表观遗传测序 单细胞表观遗传测序主要是研究DNA的表观遗传修饰，如甲基化、羟基化以及组蛋白修饰等。目前最为常用的是单细胞甲基化测序(single cell methylation sequencing, scM-seq)。scM-seq主要有3种方法： 单细胞限制性代表区域甲基化测序(methylation sequencing of single cell restricted representation regions, scRRBS-seq)、单细胞亚硫酸氢盐测序(single-cell bisulfite sequencing, scBS-seq)、单细胞全基因组甲基化测序技术(single-cell whole genome bisulfite sequencing, scWGBS-seq)。其中scBS-seq覆盖的GpG位点最多，约370万个。

1.2.4 多组学测序 同时进行单细胞基因组和转录组测序的方法主要有3种： (1) scGT-seq(single-cell genome and transcriptome codetection and sequencing)： 采用微流体的方式将两者分离进行测序；(2) G&T-seq(genome and transcriptome sequencing)： 采用物理方法将两者分离测序；(3) DR-seq(gDNA-mRNA seque-ncing)： 采用拟线性扩增法[12]。

同时进行三重组学的测序： 单细胞三重组学测序(single-cell triple omics sequencing, scTrio-seq)可同时检测同一个单细胞内的基因组、转录组和DNA甲基化组的信息。这种方法是采用一种温和的裂解方案，仅裂解单个细胞的细胞质从而将mRNA释放到溶液中，同时保持细胞核完整。再将裂解产物离心分离含有mRNA的上清液与含有核的沉淀，并将各自转移到不同的管中。对上清液进行scRNA-seq，然后再用scRRBS-seq方法对沉淀物进行DNA甲基化测序。从而可以同时得到来自同一细胞的基因组、转录组和DNA甲基化的信息[13]。

1.3 单细胞测序的流程

单细胞测序主要涉及四大步骤，包括单细胞分离、核苷酸序列(DNA或RNA)扩增、基因测序和数据分析。

1.3.1 单细胞的分离 实体肿瘤组织单细胞分离主要通过酶解法或机械法获取单细胞悬液，再从其中分选出合适的细胞群进行后续操作；循环肿瘤细胞可以直接进行分选，分选方法包括通过表面标记/表型分离的方法(流式细胞术、微流控、显微操作、光镊和激光捕获显微切割)[14-15]和稀有细胞群的获取方法(nanofilters，MagSweeper，激光捕获，Cell Search，DEP阵列和CellCelector)[16]。

1.3.2 核苷酸序列扩增 人类二倍体单细胞中DNA重量仅为6pg，远低于NGS所需的ng～μg DNA量,因此进行单细胞测序时需要高效准确的DNA扩增。DNA扩增的方法主要有： (1) PCR技术[引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、变体置换DOP-PCR(D-DOPPCR)]；(2) 多重置换扩增技术；(3) 微孔置换扩增系统;(4) 多重退火和基于循环的扩增循环[14,17-19]。同时，单细胞中含10pg的总RNA和0.1pg的mRNA,需要将mRNA高保真性高效地反转录为cDNA双链，再进行扩增。转录组扩增的方法包括： (1) smart-seq(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)或smart-seq2；(2) Phi29转录组扩增；(3) 基于PCR的半随机转录组扩增；(4) UMI[12]。

1.3.3 建库测序 基因测序是通过构建文库，利用各种测序方法，分析基因或转录组碱基序列、基因的表观遗传修饰。

1.3.4 数据分析 数据分析是指通过各种算法对测序结果进行搜索(收集和筛选)，处理(编辑、整理、管理和显示)及利用(计算、模拟)，从测序结果中获取有用信息的一种方法。

2 单细胞测序技术在肿瘤研究中的应用

2.1 揭示肿瘤发展过程中单细胞基因变异

Kim等[20]从2个肺腺癌患者来源的肿瘤细胞异种植入的小鼠(PDX)中提取了83个细胞进行单细胞转录组测序,对其中43个小鼠的重复样本进行全外显子测序，观察到包括KRASG12D在内的50种肿瘤特异性单核苷酸变异，发现了所有的PDX细胞之间均具有异质性[20]。

Ni等[21]通过对一种肺癌亚型(不包括其它亚型)的循环肿瘤细胞进行单细胞外显子测序，发现个体(甚至不同)患者的CTC中一些高度重现的CNV与耐药相关，一些基因位点(如c-Myc，TERT，HLA)的特定组合的CNV与转移相关，可能的机制是： 原发性肿瘤中的癌细胞与某些CNV可以侵入周围组织并有效浸润，这也可能使CTC发生免疫逃逸。这些为肿瘤的无创诊断和个体化治疗提供了新思路。

2.2 发现肿瘤的异质性

肿瘤的异质性是肿瘤细胞增殖过程中细胞遗传物质在复制、转录和翻译的不同层面发生变化，导致子代细胞在基因型和表型中均存在差异。肿瘤的异质性主要体现在4个层面： 不同肿瘤之间、同一肿瘤的不同病灶之间、同一个肿瘤的同一个病灶的不同区域、同一肿瘤的同一病灶的同一区域的不同细胞之间。Kim等[22]用肾切除术后1年内出现独立肺转移灶的透明细胞性肾细胞癌患者的肺转移的肿瘤组织，以及原发的及肺转移的肿瘤细胞异种植入的小鼠的116个细胞进行单细胞RNA测序,在单细胞水平上发现了肿瘤内部的异质性，发现顽固性患者体内有不同的靶向药物通路活化，制定了靶向转移的癌细胞中的两个相互独立的通路的治疗战略。Hou等[23]从1例患者的骨髓样本中随机选取了82个骨髓细胞以及8个正常口腔黏膜上皮细胞，进行了单细胞全部外显子测序，发现骨髓增殖性肿瘤患者的肿瘤细胞与正常细胞的基因表达谱完全不同，不同肿瘤细胞之间的基因表达也存在差异，呈现遗传多样性。发现不同的细胞同时存在多种基因突变的短暂时期，其中有明显的生长优势的细胞群发展成为肿瘤。

2.3 探究肿瘤各亚型之间的基因序列差异

Venteicher等[24]对10例IDH-A肿瘤患者的9879 个单细胞和6个IDH-O肿瘤的4347个单细胞进行了单细胞转录组测序，并将测序结果与165个TCGA的数据对比，发现在IDH-A和IDH-O中观察到有相同的胶质谱系和发育层次结构，表明所有IDH突变胶质瘤起源于同一个祖细胞。与神经胶质谱系的相似性相反，IDH-A和IDH-O在其肿瘤微环境中差异显著，特别是小胶质细胞/巨噬细胞的富集程度。小胶质细胞和巨噬细胞在不同临床分期的IDH-A肿瘤之间也不同。这一研究成果对于此类疾病的管理和治疗具有重要意义。Casasent等[25]从10例乳腺导管原位癌和浸润性导管癌患者的肿瘤组织中分离了1293个细胞，并对这些细胞进行了外显子测序，发现了浸润性导管癌与导管原位癌原位癌之间有直接的基因相关性(有相同的突变和CNAs)，来自同一个谱系，在发生浸润性改变之前就已经发生浸润性导管癌中的基因突变和复制子变化，一个或多个克隆迁移到周围组织形成了浸润性肿瘤。

2.4 区分肿瘤中的免疫细胞亚群

Zheng等[26]从6例肝细胞癌患者的外周血、肿瘤组织、肿瘤邻近部位正常组织中分离了5063个T细胞，进行了单细胞转录组测序，对T细胞进行了细胞亚群分类、发展轨迹分析，比较了不同亚群中T细胞克隆的分布，探讨了不同亚群之间的关系，发现了每个亚群的特异性基因表达，发现相较于外周血和癌旁组织的T细胞，肿瘤组织中大量存在CD8+T细胞的功能紊乱及抑制性T细胞。并证明Layilin基因对于CD8+T细胞的杀伤功能有抑制作用，可能会成为免疫疗法的新靶点。同时，基于TCR数据分析发现，肝癌内存在大量处于耗竭状态的T细胞，揭示了肿瘤细胞免疫逃逸的原因。此外，该研究还描绘了初始T细胞向耗竭状态的发展轨迹，并在耗竭性CD8+T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在，提出了耗竭的CD8+T细胞可能会进一步发展成抑制性T细胞。

2.5 探索肿瘤的发生过程

Tanga等[13]运用最新的scTrio-seq技术对1例肝癌患者癌组织中的25个癌细胞同时进行了3种组学的分析。发现这25个肝癌细胞来自2个不同的细胞亚群。在基因组水平上，亚群I中的细胞含有较多拷贝数增加的染色体及染色体片段，而亚群II中含有较多拷贝数减少的染色体和染色体片段；在DNA甲基化水平上，亚群I比亚群II有更高的DNA甲基化水平，且产生的差异大多发生在CpG岛(CGI)区域；在转录组水平上，多个与炎症免疫应答相关的基因，以及与补体激活相关的基因表达在亚群I中都明显降低，而与癌症发生和转移相关的重要基因ANO1和S100A11等的表达在2个亚群中也有明显差别。对于多种组学数据的分析显示，在被检测肝癌细胞中，数量上占比较小的亚群I的细胞的DNA拷贝数变异更多，且DNA甲基化水平更高，可能更易逃脱患者免疫系统的识别，更易出现肿瘤转移。

2.6 阐释肿瘤的耐药机制

Miyamoto等[27]从13例雄激素抵抗(AR)的患者体内收集77份CTC进行单细胞转录组测序。通过将AR患者CTC与未进行治疗患者的CTC进行对比，发现AR组Wnt信号通路激活。从而阐释了前列腺癌细胞对雄激素剥夺疗法抵抗的原因。Kim等[20]从2例肺腺癌患者来源的肿瘤细胞异种植入的小鼠(PDX)中提取了83个细胞进行单细胞转录组测序,对其中43个小鼠的重复样本进行全外显子测序，观察到包括KRASG12D在内的50种肿瘤特异性单核苷酸变异，发现了所有的PDX细胞之间均具有异质性。作者根据KRASG12D突变和69个肺腺癌预后基因表达的风险评分将PDX细胞分为4组，发现表达KRASG12D和低风险评分的组的PDX细胞在体外抗癌药物治疗后依旧存活,说明表达KRASG12D和高RS的PDX细胞可能与耐药相关。此外，高表达KRASG12D和高RS的PDX细胞会掩盖无KRASG12D(KRASWT)和/或低RS细胞类型。具有不同作用机制(细胞毒性和靶向特异性信号转导途径)的杀肿瘤抗癌药物能将高表达KRASG12D和高RS的细胞转变为低表达KRASG12D和低RS的PDX细胞。从而说明： (1)具有激活的KRAS标签的肿瘤细胞是药物靶标，但KRAS突变本身不是靶标;(2)与耐药性相关的肿瘤群体可能被群体内的显性基因组特征的群体掩盖。(3)参与离子通道转运的基因和P型ATP酶的上调可能在耐药性中起关键作用。

3 单细胞测序技术的局限性

尽管运用单细胞测序技术研究肿瘤的发生发展和转移已经有了一定的成果，但无论是单细胞测序技术本身还是在肿瘤研究中的应用都有一些问题尚待解决。(1) 覆盖率低。(2) 缺乏一定的空间信息。单细胞测序在单细胞分离过程中将单个细胞从组织中分离出来，整个测序过程不能还原其本身的结构，尚且需要结合免疫组化等其他方法进行空间定位。(3) 缺乏从循环肿瘤细胞中获取更高纯度的肿瘤干细胞的方法[28]。(4) 对于实现DNA高效率高保真度扩增的方法以及实现mRNA反转录转化为高效率高保真度的DNA双链的方法的研究仍需继续深入。(5) 仍需探索捕获更多GPG位点的方法。

目前大多数针对肿瘤的研究尚且聚焦于单细胞基因组水平，转录组、蛋白质组和表观遗传的研究尚且不多。不能完整的揭示整个肿瘤的发生发展和转移的过程。

4 展 望

单细胞测序技术能鉴别肿瘤发展过程中的基因变异及其变异率、肿瘤的异质性、追溯关键基因的克隆起源、肿瘤各亚型之间的基因序列差异，区分肿瘤中的免疫细胞亚群、探索肿瘤微环境，探索肿瘤的发生过程，阐释肿瘤的耐药机制，提高肿瘤的治疗效果。虽然单细胞测序技术尚存在一些局限性，但它为研究肿瘤发生发展和转移的分子机制提供了新技术，有望在肿瘤的早期诊断、病程进展和治疗的方面提供新的预防和治疗手段。可以将单细胞测序技术应用于肺癌领域，从基因组、转录组和表观遗传3个方面鉴别肺癌发生、复发、转移的原因，不同类型肺癌的预后不同的原因，不同患者对放化疗和药物治疗反应性不同的原因，并寻找这些事件发生的标志物，以该标志物为指导进行疾病的预防、诊断、手术方式以及是否进行新辅助化疗，术后放化疗和药物辅助治疗方式的选择，并可以以此为靶点研究新的治疗药物和方法。