马齿苋-肉桂联用提取工艺及其对DSS诱导溃疡性结肠炎的作用研究△

任浪浪，唐志书，梁艳妮，刘力，宋忠兴，黄文静，王征

陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种非特异性的炎症性疾病，涉及黏膜和大肠黏膜下层直肠。在特殊情况下，定义为全肠炎，可能会影响整个大肠[1]。临床表现主要为腹痛、腹泻、黏液脓血便等，内镜下结肠呈糜烂、溃疡等弥漫性炎症，组织病理学表现为黏膜或黏膜下弥漫性炎症反应、杯状细胞减少、隐窝结构破坏[2-3]。研究报道显示UC的发生与体内抑炎因子、促炎因子的失衡密切相关。炎症细胞因子异常增多或抑炎细胞因子异常减少均可促进肠黏膜炎症的变化，而持久的免疫调节失衡则促使炎症趋于慢性化[4]。溃疡性结肠炎活动期白细胞介素-10(IL-10)表达水平降低[5]，肿瘤坏死因子(TNF-α)表达水平升高，使体内免疫调节失衡，从而诱发溃疡性结肠炎[6]。目前我国UC发病呈上升趋势。课题组前期研究发现[7]，马齿苋多糖对DSS诱导的UC小鼠模型具有很好的治疗作用，可明显改善小鼠结肠的病理结构，平衡体内炎症因子和抑炎因子的水平。有文献报道，肉桂水提液对UC有很好的疗效[8]。我校国家中医药管理局脾胃病重点学科学术带头人刘力教授在30多年的临床实践中发现，马齿苋-肉桂联用对治疗UC具有良好效果，但其作用机理尚未明确，目前也没有关于马齿苋-肉桂联用治疗UC的文献报道。故本课题组对马齿苋-肉桂联用的最佳配比及其治疗UC的作用进行研究。

1 材料

1.1 仪器

电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；紫外-可见分光光度计UV-2006(岛津有限公司)；FA2004B型电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；IMS-50制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；酶标仪(Multiskan GO)-1510 (Thermo Fisher)。

1.2 材料

1.3 动物

昆明种SPF级雄性小鼠60只，体质量(20±2)g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，实验动物质量合格证许可证号：SCXK(陕)2017-003。

2 方法

2.1 马齿苋-肉桂联用提取工艺研究

前期研究发现马齿苋多糖对UC小鼠具有确切的治疗作用，故马齿苋-肉桂联用最佳配比评价采用马齿苋多糖含量为指标，以临床常用配比马齿苋-肉桂(12∶5)为参照。

2.1.1 多糖标准曲线的绘制 用苯酚-硫酸法绘制标准曲线[9]，得回归方程为Y= 5.461 6X+ 0.092 3(r= 0.999 3)，线性范围为0.025～0.15 mg·mL-1。

2.1.2 多糖提取率的计算 根据不同的提取工艺进行提取，将提取液浓缩至黏稠状冷冻干燥，称取0.010 g冻干样品，纯净水定容至100 mL，即得样品供试液；精确吸取供试液1 mL，用紫外分光光度法在490 nm处测得吸光度A值。按照标准曲线求多糖浓度，计算冻干样品中多糖的含量。多糖提取率为多糖占马齿苋配伍肉桂原药材质量的百分比。

2.1.3 马齿苋-肉桂配比对多糖提取率的影响 在料液比1∶40、提取温度100 ℃、用水提取4 h的条件下，考察马齿苋-肉桂不同配比对多糖提取率的影响。

2.1.4 料液比对多糖提取率的影响 在马齿苋-肉桂配比12∶5、提取温度100 ℃、用水提取4 h的条件下，考察不同料液比对多糖提取率的影响。

2.1.5 提取温度对多糖提取率的影响 在料液比1∶40、马齿苋-肉桂配比12∶5、用水提取时间4 h的条件下，考察不同提取温度对多糖提取率的影响。

3.谈判技术。谈判是指有关组织或个人以口头语言为载体，对涉及自身利益的分歧和冲突进行反复磋商，寻求解决途径和谋求达成协议的过程，它是知识、信息、口才、修养等诸方面的较量和角逐。［3］人类社会诞生至今就无时无刻不充斥着利益冲突，在这个意义上，人类的历史就是一部谈判的历史。

2.1.6 提取时间对多糖提取率的影响 在料液比1∶40、马齿苋-肉桂配比12∶5、提取温度100 ℃的条件下，考察不同提取时间对多糖提取率的影响。

2.1.7 正交试验 在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察指标，以L9(34)进行正交试验[10]，正交试验因素水平见表1。

表1 马齿苋-肉桂提取工艺正交试验因素水平表

2.2 动物实验

2.2.1 分组及给药方法 昆明种雄性小鼠60只，随机分6组(每组小鼠体质量进行方差分析，P>0.05)，适应性饲养1周。分为空白组、UC模型组、柳氮磺胺吡啶组[11]、马齿苋-肉桂低中高剂量组。空白组小鼠饮用纯净水，其他小鼠自饮3%DSS 9 d诱导UC模型[12]，造模第1天起记录小鼠的体质量、大便质地、潜血或便血特征[13-15]，根据表3进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分。

UC模型建立成功，第10天开始给药治疗，空白组和模型组灌胃5% 0.9%氯化钠溶液，每天1 mL；柳氮磺胺吡啶组灌胃300 mg·kg-1的柳氮磺胺吡啶混悬液；马齿苋-肉桂低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液(马齿苋-肉桂的水提粉末依据最优多糖提取率19%换算而成)[16]，每天1 mL；灌胃7 d，最后一次灌胃完禁食1 d。乙醚麻醉，眼眶取血，3000 r·min-1离心10 min，吸取血清，-20 ℃保存，待测ELISA试剂盒使用；距离肛门5 cm处取小鼠结肠段约1 cm，4%多聚甲醛保存。

2.2.2 石蜡包埋和HE染色 将保存的结肠组织取出后在流水中冲洗1 h，再将组织标本放入乙醇中梯度脱水各1 h，再用二甲苯(2缸)透明1 h，然后将透明后的标本放置在65 ℃熔解状态的石蜡中1 h，浸透后取出组织放置于包埋模具内熔蜡填充制得石蜡块，并放于病理冷冻台15 min后取下固定于切片机标本架上，进行4 μm厚度连续切片，将切片放入45 ℃的恒温水浴箱中使其充分铺开以裱片，然后移入60 ℃恒温干燥箱中2 h，4 ℃保存备用。

病理HE染色，将烤好的切片用二甲苯脱蜡2次(每次15 min)，然后依次放入浓度梯度的乙醇和蒸馏水中各8 min，再将切片移入苏木素染液中3 min，然后用流水洗去苏木素染液终止染色，待其干后放入1%盐酸乙醇溶液分化3 s，再以流水冲洗10 min后返蓝25 min，然后放入伊红液染色2 min并快速水洗以终止染色，最后将切片依次放入浓度梯度的乙醇中脱水5 min后，放入二甲苯透明2次(每次 3 min)后擦去残余的二甲苯，滴加中性树胶并盖玻片封片固定。在微镜下观察比较各组大鼠HE染色结肠组织损伤的病理变化，并予评分比较(HAI=上皮组织破坏分数+炎性浸润分数)。具体参考Cooper等[17]的评分标准予以分析比较，见表2。

表2 大鼠结肠组织HAI病理变化评分标准

2.2.3 DAI评分标准 DAI=(体质量下降评分+大便性状评分+大便隐血情况评分)/3，评分标准见表3。

表3 DAI评分表

注：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛口的，糊状或半成形大便；稀便：可黏附于肛门的稀水样便。采用联苯胺法检测大便隐血。

2.2.4 IL-10、TNF-α含量测定 按照小鼠ELISA试剂盒说明书测定小鼠血清中IL-10、TNF-α的含量。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 单因素试验

根据表4～7结果，可以得出马齿苋和肉桂12∶5时，提取率较高；料液比1∶40时提取率最高；随着温度的升高，提取率也在上升；提取时间1、2、4、5 h时，提取率增加幅度很小；提取2～4 h时，随着提取时间的延长，提取率增加。

表4 马齿苋-肉桂配比对多糖提取率的影响

表5 料液比对多糖提取率的影响

表6 提取温度对多糖提取率的影响

表7 提取时间对多糖提取率的影响

3.2 正交试验

由表8正交试验结果得出最优工艺是A3B1C3D2，即马齿苋和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取时间5 h，提取温度90 ℃。由R值可以看出C(提取时间)因素对多糖提取率的影响最大。4个因素对多糖提取率影响的大小如下：C(提取时间)>B(料液比)>D(提取温度)>A(配比)；表9方差结果分析可得出4个因素间无统计学差异，从提取效率角度选用方案为马齿苋和肉桂12∶5、料液比1∶30、提取时间5 h、提取温度90 ℃。

表8 马齿苋-肉桂提取工艺正交试验设计与结果

表9 马齿苋-肉桂提取工艺正交试验方差分析

注：F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99。

3.3 最优工艺的确定

根据正交试验的最优工艺进行提取，平行实验3次，测其多糖提取率，结果多糖提取率分别为18.85%、19.14%、19.27%，RSD=0.92%。结果表明，优选的工艺条件稳定。

3.4 DAI评分结果

根据表3小鼠DAI评分表，得出表10评分结果，小鼠自饮3% DSS 9 d后各实验组DAI评分均升高，表明小鼠造模成功，第10天灌胃治疗，给药组小鼠DAI评分均呈下降趋势，且随给药浓度的增大，小鼠DAI评分下降趋势更明显，然而不及阳性对照药的疗效，表明马齿苋-肉桂联用对UC有疗效，且比马齿苋单味药的疗效更确切[6]。

表10 马齿苋-肉桂配伍各组小鼠的DAI评分 分

注：与UC模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与空白组比较，##P<0.01，#P<0.05。

3.5 炎症因子的变化

由表11可知，模型组血清中抑炎因子IL-10的含量较空白组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，促炎因子TNF-α含量较空白组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。给药后，马齿苋-肉桂低、中剂量组IL-10的含量较模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且高于阳性对照组，相比马齿苋单味药治疗，IL-10的含量增加很多[6]；马齿苋-肉桂低、中、高剂量组TNF-α含量较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，相比马齿苋单味药治疗，TNF-α的含量降低幅度更明显[7]，较柳氮磺胺吡啶组差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明马齿苋-肉桂联用能显著改变UC小鼠炎症因子的含量，且比马齿苋治疗效果更佳，治疗效果与阳性对照药无明显差异。

表11 马齿苋-肉桂配伍各组小鼠IL-10、TNF-α含量的变化 pg·mL-1

注：与UC模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与空白组比较，##P<0.01，#P<0.05。

3.6 结肠组织观察

乙醚麻醉，处死小鼠，从肛门以上5 cm处取出小鼠结肠段约1 cm，发现空白对照组小鼠结肠颜色为淡红色，肠管内充满成形粪便。DSS模型组小鼠结肠肠壁充血肿胀，严重者整个结肠段为血性肠内容物。给药组小鼠可见基本成型粪便，结肠肠壁有轻微充血。从图1、2进一步得出：空白组结肠组织完整，包括黏膜层、黏膜下层、肌层，可见明显的隐窝和杯状细胞，腺体排列整齐；DSS诱导的UC模型组，部分肠黏膜层不完整脱落，隐窝和杯状细胞明显减少，有大量炎症因子，主要是中性粒细胞侵入黏膜层，HAI评分明显高于空白组，表明UC模型诱导成功；阳性对照组柳氮磺胺吡啶治疗后，结肠结构相对完整，有大量杯状细胞和隐窝出现，但黏膜层仍有少量炎症细胞，HAI评分显著降低，表明磺胺吡啶300 mg·kg-1可改善DSS诱导的结肠炎症状，然而，炎症细胞浸润对结肠组织的损伤并没有完全消除；马齿苋-肉桂给药100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液治疗，可见结肠组织结构完整，有隐窝和大量杯状细胞出现，但仍有少量炎症细胞浸润，HAI评分较模型组显著降低，但不及阳性药的疗效，表明马齿苋-肉桂可修复UC结肠组织，但是不能完全消除炎症因子对结肠组织的损伤。相比汪荔[7]研究，虽给药量减少，然而治疗效果却得到很大的改善，进一步表明马齿苋-肉桂联用对UC疗效甚好。

图1 小鼠结肠组织HE染色图(×400，横切)

注：与UC模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与空白组比较，##P<0.01，#P<0.05。图2 小鼠结肠组织病理切片HAI评分(n=6)

4 讨论

多糖提取工艺从马齿苋-肉桂的配比、料液比、提取时间、提取温度4个因素研究，以多糖提取率为考察指标筛选最优实验方案。即马齿苋和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取时间5 h，提取温度90 ℃为最优提取工艺条件。用3%DSS诱导昆明种小鼠UC模型，从DAI评分可得出小鼠给药后体征恢复正常；病理切片可看出小鼠给药后结肠组织有所改善；炎症因子数据表明小鼠给药前后抑炎因子和促炎因子的变化，进一步证实药物对小鼠UC模型有治疗作用。

前期课题组研究了马齿苋对DSS诱导的UC模型小鼠有确切的治疗作用，可明显改善小鼠结肠组织病理结构。马齿苋性寒，多糖是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等作用[18]，具有“天然抗生素”的美称[19]。冯澜等[20]研究表明马齿苋多糖可以提高抗炎细胞因子 IL-10 的水平并降低致炎细胞因子 TNF-α、IL-6 的水平，同时可以提高双歧杆菌和乳杆菌数量，因此马齿苋多糖通过抗炎和降低肠道过度的免疫反应以及调节肠道微生态失调，对溃疡性结肠炎发挥治疗作用。肉桂性辛、甘、热，其所含的成分如总酚类物质、槲皮苷、山柰酚被证明无论在体内还是体外试验中均具有很好的抗肿瘤作用[21]。有研究表明肉桂对溃疡性结肠炎治疗作用的分子机制可能是由于其对基质金属蛋白酶(MMPs)的抑制。马齿苋性寒，单味药治疗UC不能发挥其最大的疗效，因此配伍肉桂研究了马齿苋-肉桂最佳提取工艺、3%DSS诱导UC模型，小鼠结肠结构、DAI评分、IL-10和TNF-α的含量变化、结肠组织病理切片，表明马齿苋-肉桂联用对UC有疗效，且比马齿苋单味药疗效更佳[6]。我国UC患者逐年上升，因此研发有效安全、不良反应小的药物尤为重要。本实验仅研究了提取工艺及其在动物水平的疗效，在今后将研究其在细胞、分子和基因水平的治疗机制，为我国治疗UC提供更多选择。