超快速液相色谱-串联质谱法测定血液中的右美托咪定

孙会会 袁明俊 胡 琨 仲建军

（德州市公安局物证鉴定研究中心 山东 德州 253000）

1 引言

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）分子式是C13H16N2，分子量为200.2795，CAS号是113775-47-6，是美托咪定的右旋异构体。这种药物是一种选择性和特异性较强的α2-肾上腺素受体激动剂，能够缓解疼痛、焦虑，具有一定的催眠药效作用[1-2]。该药物能够使血流动力学稳定，对于认知功能及呼吸产生副作用较小，主要应用于重症加强护理病房内患者插管及采用呼吸机时患者的镇静。由于这种药物麻醉效果起效快，有些不法分子利用该药物使受害人失去意识，对其实施强奸等违法犯罪行为，当前，此类案件呈现多发态势，建立一种血液中该药物浓度的快速、准确的检验方法显得尤为重要。

对于右美托咪定的检验方法有气相色谱-串联质谱法（GC-MS）[3-4]、高效液相色谱法（HPLC）[5-6]、液相色谱-串联质谱法（L C-M S）[7-8]。国内对于该药物在血液中浓度测定的相关报道比较少，本文在此基础上，利用乙腈沉淀蛋白法对血液检材进行前处理，采用Shimadzu公司的LC-20 AD超快速液相色谱仪结合ABSciex 3200 Q Trap三重四级杆-离子阱串联质谱仪，选取多反应检测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）进行信号采集，对血液中右美托咪定成分进行定性，外标-标准曲线法对该药物在血液中的浓度进行定量分析。该方法前处理操作步骤简单且用时短，具有良好的重现性、较好的回收率和高灵敏度，适合人体血液中右美托咪定成分的临床毒物分析检验。

2 实验部分

2.1 仪器设备

Shimadzu Prominenece UFLC (LC-20AD泵) -ABSciex 3200 Q Trap；BSA-323S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器北京有限公司，中国）；移液器（德州艾本德股份有限公司，中国）；VORTEXGENIE2涡轮振荡器（Scientific Industries公司，美国）；TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂，中国）。

2.2 试剂

右美托咪定标准品（纯度为99.9 %，中国科学院成都科学研究所，中国）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，中国）；甲醇、乙腈（色谱纯，M e r c k公司，德国）。

2.3 右美托咪定储备液的配置

用用电子天平精确称量10.0mg的标准品于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，配置浓度为1mg/mL的右美托咪定储备液，置于冰箱中保存备用。实验中，不同浓度的右美托咪定溶液通过用甲醇稀释该储备液得到。

2.4 样品前处理

取0.5 mL血液样本于5 mL试管中，按血液和乙腈体积比1:3加入1.5 mL沉淀剂乙腈，用振荡器进行振荡混匀，以转速8000 r/min离心10 min，取出上层清液，通过0.22 μm有机微孔滤膜进行过滤，将滤液置于进样瓶中，供UFLC-MS/MS分析。

2.5 色谱-质谱条件

色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse C18（4.6 mm×150mm, 5.0μm）作为液相色谱柱，柱温设定40℃，进样量设定1μL，流动相组成是去离子水+0.1%甲酸（A相）-乙腈（B相），流速设定1.2mL/min，采用梯度洗脱程序：0~1.00min有机相B设20%，1.00~3.50min有机相B以30%/min从浓度20%升到95%，3.50~4.00min有机相B以浓度95%保持0.50min，4.10min有机相B降到20%并保持到6min，梯度洗脱程序结束。

质谱条件：选择电喷雾电离，以正离子模式，利用多反应检测模式为检测手段，离子化电压：+5500 V，碰撞气：Medium；气帘气：35 psi；喷雾气：65 psi；辅助加热气：65 psi；离子源温度：650℃；接口加热：On。经优化后，右美托咪定的质谱参数如表1所示。

表1 右美托咪定的质谱参数

3 结果与讨论

3.1 色谱-质谱条件的优化

色谱条件：实验中将甲醇、乙腈作为有机相进行分离效果的考察，结果表明在相同的色谱柱，相同的梯度洗脱程序下，乙腈作为有机相时，右美托咪定在色谱柱上的分离效果较为理想，峰形良好。在样品前处理过程中，选取乙腈作为蛋白沉淀剂，所以实验中有机相B选择乙腈。

本文分别考察了去离子水-乙腈和去离子水+0.1%甲酸-乙腈作为流动相对右美托咪定的梯度洗脱效果，结果显示在相同的条件下，去离子水-乙腈作为流动相时，右美托咪定的出峰时间拖后，分析时间过长且保留时间不稳定，峰宽较宽且有拖尾现象；选择去离子水+0.1%甲酸-乙腈作为流动相时，峰形有所改善，分离效果好，峰宽较窄。

实验选取去离子水+0.1%甲酸-乙腈作为流动相，设定B相起始浓度20%，比较3个不同的梯度陡度：10%、20%和30%，进行梯度洗脱时的洗脱效果，实验结果如表2所示。结果表明，当B相的起始浓度相同时，随着梯度陡度的上升，右美托咪定在该色谱柱上的分析时间逐渐变短，峰形变窄且响应逐渐提高[9]。实验中采取B相的起始浓度为20%，以梯度陡度30%进行梯度洗脱程序，参考Shimadzu Prominenece UFLC（LC-20 AD泵）的耐受压力，考虑到分析所用的时间，流动相的流速采用1.2 mL/min。通过上述条件，右美托咪定在该色谱柱上的保留时间为3.09 m i n，如图1所示。

质谱条件：配置100 ng/mL的右美托咪定的标准品，选择E S I+模式，利用针泵直接进样分析，优化质谱条件。在一级全扫描质谱条件下，通过手动去改变去簇电压DP，得到右美托咪定的母离子质量数[M+H]+是m/z 201.1；在确定母离子的基础上，经Product Ion MS 2获得二级质谱，手动改变碰撞电压C E，使母离子和子离子均具有一定的强度，选择质荷比较稳定且强度较大的两个碎片作为子离子，右美托咪定的定性离子对201.1/68.2和201.1/95.2；做MRMScan，通过设定去簇电压D P和碰撞电压C E的范围，进一步优化该物质的两对离子对的D P和C E，获得每对离子对的最优D P和C E。由于主要碎片m/z 95.2的背景干扰较少且响应强度较m/z 68.2更高，所以选择201.1/95.2作为右美托咪定的定量离子对。最终优化后的参数见表1。

表2 不同的洗脱条件及相关参数

图1 右美托咪定的MRM色谱图

3.2 方法的专属性

选取不同来源的空白血样6份于5 mL试管中，按照2.4步骤对血样进行处理，获得空白血样的MR M色谱图，如图2所示；向空白血液中加入一定浓度的右美托咪定标准溶液，依2.4步骤操作，得到血液中添加右美托咪定后的MR M色谱图，如图3所示。结果显示，在右美托咪定的出峰时间，空白血样中没有色谱峰出现；空白血添加中右美托咪定的出峰时间是3.09 m i n，且两对离子对m/z 201.1/95.2、m/z 201.1/68.2均出现，峰形良好且两对离子对的相对丰度比符合要求。这表明建立该方法检测血液中右美托咪定成分时，人体内的内源性物质对该物质的检测没有干扰，该方法的专属性较好。

3.3 方法的工作曲线

图2 空白血样的MRM色谱图

图3 血液中添加右美托咪定后的MRM色谱图

选取响应较高的离子对201.1/95.2进行血液中右美托咪定成分的定量分析。取5份空白血样各0.5 mL，依次添加不同浓度的右美托咪定标准溶液，配制成浓度为1、5、10、50、100 ng/mL的溶液，按照2.4的方法进行操作，在优化后的色谱-质谱条件下进行定量检测。以右美托咪定的峰面积（y）为纵坐标，溶液浓度（x，ng/mL）为横坐标进行线性回归，权重系数为1/x2，得到线性方程为y=2020 x+353(r=0.9984)。结果显示：该方法分析血液中右美托咪定成分时，在1~100 ng/mL浓度范围内具有良好的线性，如图4所示。

3.4 方法的检出限

以信噪比S/N≥3，该方法对血液中右美托咪定的最低检出限是0.2 ng/mL；以信噪比S/N≥10时，该方法对血液中右美托咪定的定量限是1 ng/mL，配置5份血液中浓度为1 ng/mL的样品进行测定，其准确度是97.8%，相对标准偏差R S D%为6.37%。

图4 右美托咪定的工作曲线

3.5 回收率和精密度

取空白血液0.5 mL，依次加入右美托咪定标准溶液，配制成浓度为1、10、50 ng/mL的样品溶液，对每种浓度做3组平行样，按照2.4的方法进行前处理，在优化的色谱-质谱条件下，进行分析检测，求得回收率；在同一天内三个不同的时间点进行分析检验，连续分析三天，得到日内精密度和日间精密度，结果如表3所示。

表3 血液中右美托咪定的回收率和精密度

3.6 案例应用

2017年1月，山东省德州市某区发生一起迷奸案件，送检单位送检了从现场提取的标有“听话水”字样的瓶子、受害人饮用过的饮料瓶及受害人的血液，要求进行毒物成分定性定量分析。利用本实验室建立的上述方法对送检检材进行检验，从受害人的血液中检出右美托咪定成分，含量为40 ng/mL。

4 结语

生物样品由于基质复杂，在分析过程中容易受到内源性物质的干扰。本实验建立了一种超快速液相色谱-串联质谱法对血液中右美托咪定成分进行定性定量分析的方法，通过多反应监测模式选取右美托咪定的两对离子对，响应强度高的一对离子对用于定量分析，检测的专一性提高，杂质的干扰较少，保证了定性定量结果的准确性。样品前处理操作步骤简单快捷，处理时间短，有机溶剂用量少，不需要衍生化操作[9-11]。该检验方法适用于实践办案中，对检材血液中右美托咪定的快速定性定量分析。