ASE-GPC/GC/MS方法检验尿液中bk-MDMA

周 欣 郑 天 刘俊宁 张绍雨 刘景宁

（1 江苏省南京市公安局物证鉴定所 江苏 南京 210001；2 江苏警官学院公安科技系 江苏 南京 210012）

1 引言

目前，国内对于新精神活性物质的研究较少，而且主要集中在针对新精神活性物质原药的分析与鉴定方面[1-2]，而体内生物检材的提取方法和检测方法研究，是当前毒品犯罪案件侦查中理化检验工作的重点内容。bk-MDMA是卡西酮类新精神活性药物, 1996年作为临床抗抑郁和抗帕金森药物使用，但不久后发现其具有苯丙胺类毒品的精神活性[3]，会造成人体一系列的如兴奋、焦虑、致幻等心理副作用，使人产生致幻、暴力、自残等行为[4]。

相较于传统的液液萃取法来说，新的提取方法在毒品检验鉴定中发挥着越来越重要的作用，例如微波萃取法[5]、超临界萃取法、快速溶剂萃取法[6]等。快速溶剂萃取是一种全自动化的萃取技术，在植物油萃取、分子印迹聚合物、光敏剂、药物及其他诸多方向的研究中均有应用。A S E萃取技术因是在高温高压状态下进行萃取，其萃取效率比常温常压[7]有大幅提升，而且全自动化操作也可以避免人为误差，有利于提高实验的重现性和精密度。考虑到生物检材中毒品原体的含量较低，将A S E技术用于毒品特别是新精神活性物质的检验，有助于提高提取率，并可通过优化A S E方法中的各项参数选取最佳条件。凝胶渗透色谱是一种体积排阻的净化技术，早期的GPC只能采用离线方式进行净化，消耗时间较长，目前已经实现了在线净化功能，大幅提高了工作效率。GPC-G C/M S又是一种采用P T V大体积进样的设备，其进样体积是普通G C/M S的5～10倍，因此具有一定的待测化合物的富集效果。

本实验将A S E提取技术和高灵敏度的检测方法GPC-G C/M S结合对尿液中的bk-MDMA进行检测分析，基本实现从前处理到净化，以及检验过程的全自动处理过程。本实验所建立的A S E-GPC/G C/M S方法可供相关人员参考使用。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

ASE350型快速溶剂萃取仪（赛默飞公司，美国），QP2010 GPC-GC/MS（岛津公司，日本），电子天平（梅特勒公司，瑞士），移液枪（吉尔森公司，法国），高速离心机（艾本德公司，德国）。

环己烷、乙酸乙酯（色谱纯，MERK，德国），硅藻土（赛默飞公司，美国），尿样采自健康志愿者（江苏省南京市公安局物证鉴定中心），bk-MDMA对照品由南京市公安局提供，并用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液。

2.2 仪器条件

2.2.1 加速溶剂萃取条件

萃取溶剂∶ 乙酸乙酯∶ 环己烷（ V ∶ V ，1∶1）；加热时间：5 min；萃取温度：110℃；循环次数：2次；静态萃取时间：5min；冲洗体积：60%；氮气吹扫时间：90s。

2.2.2 在线凝胶色谱条件

GPC色谱柱：Shodex CLNpak EV-200（2.0 mm×150 mm）；流动相：环己烷：丙酮（V∶V，7∶3）；流速：0.1mL/min；柱箱温度：40℃；紫外检测器检测波长：210 nm；进样体积：5μL；采集样品时间：3.87～5.87min。

2.2.3 气相色谱条件

色谱柱：惰性前置柱5m×0.53mm；预柱：DB-5MS（5m×0.25mm×0.25μm）；分析柱：DB-5MS（30.0m×0.25mm×0.25μm）；柱箱程序升温：初始温度82℃（5min）10℃/min280℃（5.2min）；PTV进样口：初始温度：初始温度120℃（5min）100℃/min 250℃（23.7min）；压力程序：120kpa100kpa/min 180kpa（4.4min）-49.8kpa/min120kpa（23.8min）；载气：氦气，进样方式：不分流；进样时间：7min。

2.2.4 质谱条件

离子源：EI源，70 eV；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；质量范围：50～500m/z；溶剂延迟时间：9.5min；扫描速度：1000；间隔：0.50sec；Scan模式采集。

2.3 实验方法

将10mL不锈钢材质萃取池两端加上滤膜，从底部装入硅藻土，加入1 .0mL尿样，继续填装硅藻土后从顶部加滤膜密封。按照2.2.1条件置于ASE上进行萃取。萃取液浓缩挥干，100μL定容供GPCGC/MS分析。

3 结果与讨论

3.1 ASE萃取条件优化

3.1.1 萃取溶剂的选择

在选取萃取溶剂时除考量萃取溶剂与目标化合物的相似相容性以外，还要兼顾A S E仪器本身的一些特点，例如A S E 350仪器本身不允许使用如乙醚这样燃点较低的溶剂，或者如丙酮可能会影响萃取池密封性的溶剂。实验考察了乙酸乙酯∶环己烷（V∶V，1∶1）、乙酸乙酯、二氯甲烷3种不同萃取溶剂的回收率，平行萃取5次，数据显示以乙酸乙酯∶环己烷（ V∶V，1∶1）的平均回收率96.6%，高于乙酸乙酯92.6%和二氯甲烷96.1%，如图1所示。乙酸乙酯∶环己烷（V∶V，1∶1）与二氯甲烷的回收率相当，但二氯甲烷的毒性较大，综合考虑回收率、杂质干扰和环境危害等因素，确定乙酸乙酯∶环己烷（V∶V，1∶1）为本实验的萃取溶剂。

图1 ASE萃取溶剂和目标化合物回收率关系

3.1.2 萃取温度的选择

萃取温度是萃取过程中的一个关键因素，因为温度越高越容易破坏溶剂与化合物之间的范德华力、氢键引力等，减少了溶剂的粘性和表面张力，从而能够让溶剂更好、更快、更有效地萃取目标化合物[8]。一般来说，萃取温度越高提取率越高，但温度越高杂质也会相应增加。实验考察了萃取温度在80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃条件下的萃取效果，如图2所示。结果证明，随着温度的升高，回收率增大，但温度110℃以上时回收率增加已不明显，且相应的杂质也增加，兼顾两方面因素，本实验选择萃取温度为110℃。

图2 ASE萃取温度与目标化合物回收率趋势

3.1.3 静态萃取时间和循环次数选择选择

随着静态萃取时间的增加，目标化合物在溶剂中的溶解度也逐步增加，但其效果随着时间的延长而逐步减弱。将一次较长时间的萃取过程分为两次，期间重新补充新的萃取溶剂，让目标化合物重新到达一次溶解与解析的动态平衡，将有助于萃取率的提高。而随着萃取次数的增加，目标化合物已经大部分被萃取出，这种增加循环次数的方式将无益于萃取率的进一步提高，反而会大幅度增加无效萃取时间，兼顾效率与效果的关系，将静态萃取次数选择为2次。实验考察了静态萃取时间在5 m i n、10 m i n、15 m i n条件下的萃取效果，数据显示，随着萃取时间的增加回收率并未明显增加，如图3所示。为达到时间短、回收率高的目的，本实验选择5 m i n的静态萃取时间。

图3 ASE萃取时间与目标化合物回收率趋势

3.1.4 p H值的选择和氧化铝的添加

实验比较了不同p H值条件下的回收率，在p H值7回收率能达到较高水平，如图4所示，故选择中性条件下萃取。实验还比较了添加中性氧化铝前后的变化，发现回收率和色谱图并未达到其预期的净化效果。

3.2 GPC净化条件的选择

凝胶渗透色谱技术对小分子的目标化合物b k-MDMA和尿液中大分子量的杂质，通过体积排阻的原理可以加以区分。大分子量的杂质先流出，而小分子量的b k-MDMA后流出，通过分析两者不同的流出时间，可以选择截取合适的时间段进样，达到最大限度的凝胶净化的效果。实验通过在线凝胶色谱的紫外检测器对空白尿和b k-MDMA标准溶液进行测定，如图5所示。

图4 pH值与目标化合物回收率趋势

图5 空白尿和bk-MDMA的紫外光谱图

根据两者紫外吸收峰可以看出，空白尿中的杂质主要在2.55～3.90 m i n流出，而目标化合物bk-MDMA主要在3.50～5.50 m i n流出。为达到凝胶净化的最佳效果，本实验考察了3.32～5.32 m i n和3.87～5.87 m i n两个不同采集时间段的GPC净化回收率及杂质去除效果，如图6、7所示。

实验结果发现：在3.32～5.32 mi n时间段内，b k-MD MA的特征离子m/z 58对应的峰面积11906243；在3.87～5.87 m i n时间段内，bk-MDMA的特征离子m/z 58对应的峰面积23102309,并且通过总离子流色谱图也可以看出，在3.87～5.87 m i n时间段内GPC的净化效果较好。因此，选择在3.87～5.87 m i n时间段内收集组分，既能保证目标化合物有较高的回收率，同时又可最大程度地避免大分子尿素、蛋白质等杂质的干扰，达到GPC在线净化的目的。

图6 空白尿标准添加GPC净化不同采集时间段的总离子流色谱图

图7 空白尿标准添加GPC净化不同采集时间段的选择离子流（m/z58）色谱图

3.3 方法学验证

3.3.1 色谱条件的考察

在选定的仪器条件下，目标物具有尖锐的色谱峰型，空白尿在此无干扰。bk-MDMA的保留时间16.8 m i n，特征离子m/z为58、91、121、149、207。

3.3.2 方法的工作曲线和检出限

按照2.3的实验方法取空白尿液1 mL，分别加入一定量的bk-MDMA标液配制成浓度为0.1、0.5、1.2.5、5 μg/mL的添加样品进行测定，以bk-MDMA的浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线，线性回归方程为Y=264330 X-19451,相关系数R2=0.9997。方法的检出限（S/N=3）为0.01 μg/mL。

3.3.3 方法的回收率和精密度

按照2.3的实验方法，取空白尿液加入不同浓度的bk-MDMA标液进行测定，每种浓度平行5份样品，其回收率和相对标准偏差（R S D）如表所示。由表所示结果可知，5种浓度的b k-MD MA的回收率在92%～94.7%之间，相对标准偏差（n=5）在2.1%～3.8%之间。

表 bk-MDMA在尿液样品中的加标回收率（n=5）和精密度

本实验采用A S E进行尿液的前处理过程实现了全自动操作，有效避免了人工误差，利用在线GPC-G C/MS进行分析，回收率在92%～94.7%之间，相对标准偏差在2.1%～3.8%之间，方法的回收率和重现性等方法学指标均符合微量分析要求。实验结果表明，采用A S E-GPC/G C/M S测定尿液中bk-MDMA的方法，具有溶剂用量少、回收率高、杂质少等特点，特别是方法的在线提取、净化和检测过程自动化程度高，极大地提高了工作效率，适用于司法案件尿液中bk-MDMA的检测分析。