2016年福建省单核细胞增生李斯特菌临床病例及食品来源菌株的分子特征分析

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单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种重要的食源性人兽共患病原菌，老人、儿童、孕妇和免疫力低下者容易感染，可引起胃肠炎、败血症、脑膜炎、孕妇流产等症状。孕妇感染的危险度比健康成年人高出20倍。2001年起被美国列为法定上报的疾病[1]。2011年美国一起因哈密瓜引起的李斯特菌病暴发，涉及美国28个州，导致147人患病，33人死亡，1例流产[2]，1998年，我国香港和台湾发生李斯特菌暴发事件，甜筒、冰激凌和雪糕等被污染，造成许多儿童发病[3]。冯延芳等收集文献资料统计：2000-2009年我国16个省共报告92例李斯特菌病例，病例临床特征、报告死亡率等与欧美相似[4]。我国食源性疾病监测显示，国内人感染单核细胞增生李斯特菌散发报告数逐年上升，2016年全国报告82例病例，主要以孕妇和新生儿为主。福建省单核细胞增生李斯特菌感染病例未见文献报道。为了解福建省单核细胞增生李斯特菌感染的流行病学及病例和食品来源株的分子特征，提高溯源能力，在福建省建立3家哨点医院，采用血清分型和PFGE分型方法对分离菌株进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 病例调查方法

1.1.1病例定义 具有单核细胞增生李斯特菌感染的临床表现，主要为脑膜炎、败血症、先兆流产、早产、死产等。从无菌的标本(血液、脑脊液)或妊娠产物(羊水或胎盘等)中分离到单核细胞增生李斯特菌。

1.1.2监测对象 孕妇、婴幼儿、老人等免疫力低下者。

1.1.3病例信息采集 由临床医生对符合监测病例定义的病人进行信息采集，接到报告的疾病预防控制中心对阳性病例开展流行病学调查。

1.2 菌株来源

1.2.1病例菌株 医院实验室采集生物标本按照《2016年食源性疾病监测工作手册》[5]进行单核细胞增生李斯特菌检验。3株单核细胞增生李斯特菌病例株来自2016年泉州、福州和厦门市妇幼保健院分离(其中新生儿血液标本2份、胎盘母面标本1份)。

1.2.2食品菌株 8株单核细胞增生李斯特菌来自2016年福建省食品微生物监测分离株(7株分离自市售即食食品寿司，1株分离自福建某冷冻饮品厂的环境样本)。

1.2.3单核细胞增生李斯特菌 标准菌株(CMCC 54004和CMCC54007)来自中国药品生物制品检定所；PFGE参考菌株沙门氏菌H9812由中国疾病预防控制中心传染病所提供。

1.3试剂 APIListeria生化鉴定试剂条(法国bioM erieux)，单核细胞增生李斯特菌显色培养基(法国科玛嘉)，血平板(北京陆桥公司)。Tap DNA聚合酶(BBI)，琼脂糖(TakaRa)，5×TBE、1 mol/LTris-HCL缓冲液和0.5 mol/L EDTA(Solarbio)，Tris base、EDTA 和boric Acid (BBI)，N-Lauroyl-Sarcosine Sodium salt(Sarcosy1)(Sigma), 溶菌酶(Sigma)，蛋白酶K粉末(Merck)，XbaI和AscI酶(NEB)， SeaKem Gold Agarose(Gene)。多重PCR引物由上海生工公司合成。单核细胞增生李斯特菌型别免疫血清购自日本生研公司。以上培养基和试剂均在有效期内使用。

1.4仪器 核酸扩增仪(德国Biometra)，CHEF Mapper XA及凝胶成像系统(美国伯乐)，超纯水仪(美国miniPALL)，台式离心机(德国Eppendorf)，比浊仪(法国生物梅里埃)，水浴摇床(英国Grant)。

1.5 菌株鉴定与分型方法

1.5.1菌株复核 分离株均经GB 4789.30-2010方法验证。

1.5.2血清学分型 多重PCR测定血清型别方法采用的5对引物序列参照文献[6]。免疫血清分型方法按照说明书，用玻片凝集法确定O抗原，用试管法确定H抗原。

1.5.3PFGE分子分型与聚类分析 按照单核细胞增生李斯特菌PFGE操作程序[5]进行，选用AscI酶进行plug中DNA的酶切，PFGE图谱用BioNumerics 7.6软件进行聚类分析。

2 结 果

2.1病例信息 2016年3例单核细胞增生李斯特菌感染病例中2例为早产的新生儿，1例孕妇，调查结果见表1。第1例病例抗生素治疗2 d后未痊愈，家长放弃治疗带回。第2例病例为孕妇咳嗽、乏力、发烧，柴胡退热、静滴青霉素抗感染治疗，入院查体胎心未闻及，本次妊娠为人工受精。第3例病例为新生儿败血症，抗生素治疗后存活，其母亲4周内食用过生食蔬菜、现制现售饮料和西式沙拉。

2.2菌株复核结果 11株分离株经鉴定均为单核细胞增生李斯特菌，API Listeria 生化鉴定编码均为6710。

2.3血清型别 11株单核细胞增生李斯特菌株多重PCR分型结果见图1，与传统免疫血清方法结果一致，分属3个血清型：1/2a、1/2b和4b。3株病例株中2株1/2a 型、1株4b型；8株食品株中4株1/2a来自漳州和福州的寿司、2株4b来自福州和漳州的寿司，1株1/2b来自福州的寿司，1株1/2a来自冷冻饮品厂地板分离株。

表1 2016年3例单核细胞增生李斯特菌阳性病例的临床资料及流调信息Tab.1 Clinical and epidemiological information of three confirmed Listeria monocytogenes cases in 2016

M：100bp DNA Ladder；1-12：CMCC54004(1/2a型)、CMCC54007(4b型)、DZ-47、JDZ-02、JDZ-01、JDZ-03、JDZ-04、DZ-A16043、 DZ-A16114、DZ-E16087、DZ-E16094、DZ-E16023；13-14：空白对照组

2.4PFGE型别 11株单核细胞增生李斯特菌PFGE聚类分析结果见图2，分为10种带型，其中3株病例分离株的PFGE相似度小于80%，无同源性。与同年份福建省即食食品寿司中分离株的相似度不高，亦无同源性。不同血清型4b与1/2a的PFGE带型相似度较差，为57.8%。

图2 11株单核细胞增生李斯特菌PFGE聚类分析Fig.2 PFGE profile of 11 L. monocytogenes

3 讨 论

2016年福建省监测到的3例单核细胞增生李斯特菌病例均为免疫力低下人群(孕妇和新生儿)，发生月份集中在6～8月，符合单核细胞增生李斯特菌“夏秋季呈季节性增长”的特点[3]。已有研究表明，本病病死率可高达30%～35%[3]。连凯等[7]统计我国2002-2012年报告人李斯特菌感染病例80例，总病死率为19%，其中病死率最高的人群为免疫缺陷患者(40%)，其次为新生儿患者(31%)。目前，临床上应对李斯特菌病主要采用抗生素治疗，药物首选氨苄西林[3]。早发现、及时检测、正确应对，必要时给予合理、足量的抗生素治疗可以有效防控[1]。此外，加强对高风险人群的宣教活动，可以显著降低单核细胞增生李斯特菌病的发生[8]。

本次监测的单核细胞增生李斯特菌病例菌株血清型为1/2 a和4b，即食食品分离株为1/2a、1/2b和4b，均为国内外常见的血清型。王丽丽等[9]研究北京市2013-2015年32株人源性单核细胞增生李斯特菌血清型，以1/2b和1/2a型为主，分别占53.1%和37.5%。国外报道[10]，单核细胞增生李斯特菌具有流行病学重要性的血清型有4b(占37%～64%的病例)、1/2b(占10%～35%的病例)和1/2a(占15%～25%的病例)，血清型4b引起的疾病在孕妇病例中明显较多。福建省冻畜禽肉类等市售食品中单核细胞增生李斯特菌的污染率为38.46%～30.30%，30株食品分离株血清型主要以1/2a 为主，未见4b血清型[11]。2016年即食食品寿司监测分离的7株单核细胞增生李斯特菌中发现2株4b血清型的菌株均来自海鲜寿司(含三文鱼等)，是否与进口海产有关有待进一步调查研究。应加强对即食食品中单核细胞增生李斯特菌的监测并引起重点人群的高度关注。

本次PFGE聚类分析可以看出，病例菌株的PFGE分子型别与同年度省内食品分离株之间无同源性，说明2016年监测病例均为单核细胞增生李斯特菌散发病例，且病例分离株与监测到的即食食品分离株之间无相关性。由于李斯特菌病潜伏期长，临床症状容易被忽略，流行病学调查中对可疑致病食品的回顾难度大，病原菌较难追踪溯源。应借鉴国外监测经验，纳入法定上报疾病，建立病例分离株的型别数据分析和比对，及时对聚集性病例进行流行病学调查和快速溯源，摸清流行规律，采取针对性的防治措施，才能减少单核细胞增生李斯特菌病的发生。

利益冲突：无