应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验

陈天刚 胡永芳

【摘要】目的：建立流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验的方法。方法：利用结核分枝杆菌水解HDA的特点，选取HDA作为带有荧光的材料。应用流式细胞术检测20株结核分枝杆菌对RFP，INH，SM和EMB的敏感性。MI值由不同浓度药物影响细菌后培养物检测到的平均荧光强度与阳性对照的比值来推断[1]：20株结核分枝杆菌的流式细胞仪药敏试验结果与比例法基本一致。结论：建立流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏具有快速、准确、简便等优点，可用于临床结核分枝杆菌药敏的检测。

【关键词】结核分枝杆菌;微生物敏感性试验;流式细胞术

【中图分类号】R378.911【文献标志码】A【文章编号】1005-0019（2019）02-056-01

结核病是一种严重危害人类健康的传染病。近年来，世界上结核病的发病率明显增加，中国也不例外。在结核病控制过程中，结核分枝杆菌的耐药性，尤其是耐多药结核分枝杆菌的耐药性，已成为结核病预防工作的严重障碍。耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）与非标准临床治疗密切相关，需要快速、灵敏的药物检测方法。建立结核分枝杆菌快速药敏试验是有效控制结核病的重要方法。目前，比例法已广泛应用于国内各实验室进行分枝杆菌的药敏试验。这种方法在分离菌株后获得药敏试验结果需要四周的时间。在二十世纪八十年代建立的BACTECTB 460分枝杆菌检测系统基础上开发的BACIECMG TI960可缩短获得药敏试验结果的时间到5-8天，但存在要求特殊仪器、试剂比较昂贵、有一定的污染率等缺点。近年来，随着流式细胞仪器在医院中的普及，流式细胞术在细菌药敏试验中的应用得到了很大的发展。细菌与荧光染料的结合程度可判断细菌的活性。快速药物敏感性试验具有重要意义。应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验已取得一定进展。然而，中国却没有媒体报道这一点[2]我们对此进行了研究。研究过程和结果如下：

1材料

1.1 菌株 结核分枝杆菌H37Rv标准株，以及于2018年1月至2018年2月在重庆市公共卫生医疗救治中心分枝杆菌实验室采集到的临床分离株，鉴定出20株结核分枝杆菌，其中10株为耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）。

1.2试剂  利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、乙酰乙酸荧光素和IMSQ均购自Signa，7H9液体培养基购自美国BD公司。FDA溶于DMSO，配置为1g/L的溶液，储存在-20C。

1.3仪器  流式细胞仪为BD FACSCalibur型号，是美国BD公司制造的。

2方法

2.1 标准菌株的药敏试验  在罗氏培养基上挑取H37Rv标准菌株的菌落，在含有玻璃珠的无菌瓶中磨成干酪样品。用生理盐水制备1g/L菌悬液。将1 g/L菌悬浮液稀释至10-2 g/L细菌提取物Q1MI，接种到含有不同浓度药物的7H9液体培养基中。INH的最终浓度为1.25、2.5、5、10、20mg/L，RFP为1.25、2.5、5、10、20mg/L，SM为2、4、8、16、32mg/L，EMB为0.625、1.25、2.5、5、10mg/L，7 H9培养基为空白对照。然后将8%多聚甲醛添加到FDA37℃培养30min，用流式细胞术来确定最终和平均荧光强度。

2.2临床菌株的药敏试验  根据标准菌株药敏试验，筛选出检测临床菌株的最佳实验方案。将20株临床分离的结核分枝杆菌接种于含不同药物浓度的7H9液体培养基中，最终INH浓度为2.5、5、10mg/L，RFP为5、10、20mg/L，SM为8、16、32mg/L，EMB为1.25、2.5、5 mg/L，在37℃培养72h，分别加入终浓度为250Lg/L的FDA 37℃孵育30min， 加入8%多聚甲醛处理40min，用流式细胞仪测定细菌的平均荧光强度。

2.3流式细胞仪检测  首先，利用荧光微球对仪器的光路和液体流动系统进行标定，确保仪器各项指标均在允许范围内，并将前角（FSC）和侧角（SSC）的信号值设定为对数a。美化。根据FSC/SSC的信号调节电压，以发现最集中的细菌。通过直方图计算FDA在FL通道上的平均荧光强度（MF I），最低抑菌浓度（MIC）。通过比较药物管与不含药物的阳性对照管的MF的60%或更多来确定。

2.4比例法检测结核分枝杆菌的药敏试验  参照《结核病诊断实验室检验规程》91操作。

2.5统计分析  使用  SPS91.0统计软件进行分析，配对资料采用X2检验，RQ05为差异有统计学意义。

3结果

流式细胞术检测不同时间的对照结果，可以看出培养时间为72个小时最为适宜，在流式细胞术检测临床株的药敏试验结果与绝对浓度法结果比较上，我们可以发现通过这两种方法检测的结果没有差别。

4讨论

FDA是一种无极性、无荧光酯，本身不发荧光，渗入活细胞后，可被胞质中的酯酶迅速水解释放出荧光素，在488mm的蓝光激发下，发射出黄绿色的荧光，可经流式细胞仪检测。  利用FDA的特点，使之与结核分枝杆菌作用，该物质能穿透活的分枝杆菌细胞壁并能被胞质中的非特异性酯酶迅速水解为游离的荧光素，而死菌和被抗结核药物抑制的细菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解FDA游离荧光素产生会相应减少，通过流式细胞仪检测带荧光的分枝杆菌的荧光强度的变化来推断MIC获得药敏试验结果[3]首先建立了结核分枝杆菌标准菌株H37R的流式药敏试验方法，药物和细菌作用后我们可以得到结果，结果和状态或与样品的处理有关。在试验过程中为防止实验室污染，保证操作者的安全，上样前对样品用8%的多聚甲醛处理，使结核杆菌失活，但发现甲醛的处理后会使部分试验管的荧光强度有所降低，在一定程度上影响了试验结果，这一问题还有待解决。

5结语

结核分枝杆菌细胞学敏感性试验简便、快速、灵敏、重复性好。如果它被發展成一套成熟的方法，它可以作为一个常规的临床试验来执行。因此，结核分枝杆菌药物敏感性实验的快速检测，从28天到2-3天，一方面有利于结核病的治疗，另一方面也能及时发现耐多药结核患者，减少结核患者的传播。

参考文献

[1]李庆炎.翟志敏.流式细胞术用于念珠菌快速药敏试验的研究[J]中国临床保健杂志201 10（2） 1227-1229.

[2]马筱玲，李志敏.流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度[J]中华微生物学和免疫学杂志，2016（4）3639-3645.

[3]夏晓华，泉.流式细胞术应用于金黄色葡萄球菌体外药敏试验的初步研究[J]中国人兽共患病杂志，20164）5053-5058.