糖尿病大鼠在不同血糖浓度下伤口愈合情况实验研究

曾文超，巩茹，郭洪敏，巩超，王福宁，赵阳，岳震

(山东省济宁市第一人民医院手足踝外科，山东 济宁 272000)

糖尿病及其相关并发症已经成为一个公共健康问题，因为有较高的致残率及死亡率，积极预防、治疗糖尿病及其并发症成为一个至关重要的课题。糖尿病足近年来逐渐发展为糖尿病最重要的并发症[1-2]。1/4的糖尿病患者苦于糖尿病足的困扰。糖尿病足部溃疡处置不当导致伤口不愈合，最终发展为难治性溃疡，甚至截肢。根据世界卫生组织的报告，到2030年，全球糖尿病的发病率将从1.71亿上升到3.66亿[3]。本实验旨在研究糖尿病大鼠在不同血糖浓度下创面愈合情况，并与正常血糖浓度下伤口愈合情况进行比较，观察在低水平高血糖时难治性溃疡的生长愈合情况，为人类的糖尿病治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物准备 普通3～4个月龄雄性大白鼠(180～220 g)，生活环境为：温度(24±1)°，湿度45%～55%，昼夜12 h交替。独立透明鼠仓生活，食用全价营养颗粒饲料，饮用医用过滤水，所有实验操作均在上午6点至下午6点。饲养小鼠1个月，持续监测血糖，血糖值为(131.4±36.2)mg/dL，雌雄动物间，各饲养单位间差异无统计学意义，正常血糖值范围可估计为60～160 mg/dL。

药物准备：链唑霉素由美国sigma公司生产，其余普通试剂均为国产。

诱导及评估：单次剂量55 mg/kg链唑霉素溶于柠檬酸盐缓冲液腹腔注射，诱导大白鼠糖尿病模型。10 d后测量大白鼠空腹血糖，血清葡萄糖利用血糖分析仪(美国强生公司)评估。血糖水平不低于250 mg/dL纳入样本范围，根据血糖水平高低分为三组，每组10只，分别给予皮下注射胰岛素控制血糖，低血糖组(血糖控制在160～190 mg/dL)、中血糖组(血糖控制在190～240 mg/dL)、高血糖组(血糖控制在240 mg/dL以上)。血糖控制平稳后继续饲养1个月。

动物分组：将诱导成功大白鼠根据血糖控制水平依次分为四组。I组：糖尿病诱导后给予胰岛素控制血糖在160～190 mg/dL；Ⅱ组：糖尿病诱导后给予胰岛素控制血糖在190～240 mg/dL；Ⅲ组：糖尿病诱导后给予胰岛素控制血糖在240 mg/dL以上；Ⅳ组：糖尿病诱导后给予胰岛素控制血糖在160 mg/dL以下。各组均按照模具在相同部位给予相同面积皮肤切除。

1.2 手术形成创面模型 选择的大白鼠模型均在局部麻醉下进行手术处理。麻醉药物选用5%利多卡因皮下注射，在每只大白鼠背侧去除面积约为1 cm×1 cm全厚皮，形成创面。

1.3 术后处置 分别于伤后0(伤后当天)、3、7、14d处死大鼠，透明方格纸获取创面形状，利用Osiris软件进行创面愈合率测算。

取创面组织标本：部分用体积分数10%甲醛固定后制成石蜡块保存，其余标本一80℃保存待用。将石蜡标本制成薄切片，常规HE染色后，光学显微镜下观察创面组织病理学改变。

2 结 果

2.1 伤口愈合情况 伤后3d Ⅳ组及Ⅰ组创面愈合率稍高于Ⅱ、Ⅲ组。但在伤后7 d及14 d，Ⅳ组及Ⅰ组创面愈合率明显高于Ⅱ、Ⅲ组，差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ组伤口愈合率相比Ⅳ组较快，差异有统计学意义(P<0.01，见表1)。

表1 糖尿病大鼠创伤模型术后伤口愈合情况

2.2 病理结果 显微镜下Ⅳ组、Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组相比，皮肤组织结构更加完整，层次清晰，胶原含量较丰富，排列有序，真皮层内炎性细胞浸润少，创面炎性细胞浸润强烈而局限，坏死组织形成、脱落及时，创面愈合无明显延迟。巨噬细胞明显增加。Ⅰ组与Ⅳ组相比，巨噬细胞含量明显增加。但Ⅰ组与Ⅳ组巨噬细胞含量差异无统计学意义(见图1)。

a I组，糖尿病诱导+胰岛素控制血糖在160～190 mg/dL

b Ⅱ组，糖尿病诱导+胰岛素控制血糖在190～240 mg/dL

c Ⅲ组，糖尿病诱导+胰岛素控制血糖在240 mg/dL以上

d Ⅳ组，正常血糖范围

3 讨 论

糖尿病所形成的溃疡是糖尿病后期最常见的并发症之一，也是导致截肢的主要原因之一。目前，关于糖尿病溃疡经久不愈的机制尚不清楚。其愈合过程与其他创面愈合类似，包括：炎症期、肉芽组织增生期和组织重建期。目前认为糖尿病溃疡不愈合的主要原因包括：a)局部组织胰岛素水平低下导致的创面组织细胞代谢异常；b)创面局部炎症反应失调；c)晚期糖基化产物在皮肤堆积。

研究表明，炎症反应的失调是糖尿病引起的溃疡经久不愈的主要原因[4]。在炎症早期，巨噬细胞在趋化因子的作用下，移行至创面周围，在内皮细胞等释放的一系列生物活性物质的作用下被激活。激活后的巨噬细胞吞噬周围病原微生物；清除异物、坏死组织；分泌多种细胞因子，促进创面愈合。创面巨噬细胞浸润数量和功能与皮肤愈合的关系已经得到广泛认同。Karkkainen认为[5]高血糖水平导致的伤口巨噬细胞浸润受阻是伤口延迟愈合或不愈合的重要原因。在创面修复增生期，巨噬细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1、转化生长因子等促进肉芽组织形成，同时巨噬细胞也可以分泌血管内皮生长因子，可以促进新生组织中的血管形成。Altavilla等[6]人认为，在皮肤组织中，巨噬细胞是分泌血管内皮生长因子C的主要细胞之一。Maruyama等人认为糖尿病小鼠皮肤溃疡处的巨噬细胞数量减少，分泌VEGFC的功能降低[7]。魏民在研究中发现糖尿病足部非缺血性溃疡难愈合，创面皮肤中巨噬细胞数量减少，分泌VEGFC的功能降低，其主要原因可能为高糖和/或糖基化终末产物的共同作用[8]。这可能是糖尿病患者创面难愈合的重要原因之一。

在血糖水平较高的情况下，葡萄糖分子与蛋白质分子容易发生一系列化学反应，生成AGEs[9]，长时间的高血糖水平导致AGEs沉积于皮肤组织，促使胶原糖基化，形成相互交叉耦联的高分子量物质，不易被生物酶所降解[10]，从而影响组织重塑，导致血管形成障碍，最终创面难以愈合[11]。另外，糖基化反应可影响某些参与创面修复的功能蛋白质分子功能，如糖基化反应使表皮生长因子受体失去信号转导功能，导致血管内皮生长因子等生长因子的促细胞增殖功能减弱，不利于创面修复[12]。另外非酶促糖基化反应过程会释放大量活性氧自由基，导致机体处于氧化应激状态，影响胶原合成，创面愈合延迟[13-14]。

在本项研究中，证实了高血糖环境下伤口周围组织的巨噬细胞会出现明显减少，并且皮肤组织中的AGEs含量明显增加。两个因素均对伤口的愈合过程产生了不利影响。从伤口愈合的比例来看，也如以前的研究结果相同，高血糖的环境下伤口愈合明显延迟，个别小鼠在高血糖环境下伤口不仅没有缩小，反而扩大。但比较第Ⅰ及Ⅳ组可发现，大鼠血糖维持在稍高于正常血糖(Ⅰ组)的环境下，对伤口愈合没有出现负面影响，反而伤口愈合速度较Ⅳ组快，巨噬细胞及皮肤AGEs无明显差异，可能有其他因素在低高血糖水平有利于伤口新生血管及肉芽组织的形成，这需要进一步实验研究。另外，血糖控制在什么范围会对伤口愈合产生有利环境，仍需进一步实验探索。临床实践中是否会与实验结果相符，也需要进一步临床认证。

糖尿病大鼠高血糖浓度会严重影响创面愈合，并随着血糖浓度升高影响愈加明显，但在低水平高血糖浓度下会对伤口愈合产生一定有利环境，这仍需临床上的实践证明。