宫颈病变患者外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞的表达变化及临床意义

夏良萍 刘大标

江苏省镇江市第四人民医院检验科，江苏镇江 212001

女性恶性肿瘤中宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，我国宫颈癌发病率为99/10 万，死亡率为30.5/10 万［1］。宫颈癌形成前有一个漫长的宫颈病变阶段，即慢性宫颈炎症、宫颈上皮内瘤样病变等，早期诊断并判断病情进展情况，对制订宫颈癌防治措施具有重要价值［2］。研究发现［3］，在宫颈病变过程中，细胞免疫功能异常，免疫系统抑制后，对上皮突变细胞的识别与杀伤能力明显降低，促进恶性肿瘤细胞的生长和转移。T 淋巴细胞亚群介导了细胞免疫反应，且具有维持机体内环境稳态和杀伤肿瘤细胞的功能，调节性T 细胞参与免疫负调控过程，抑制多种免疫细胞的活化［4-5］。本研究通过检测外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞的表达水平，旨在探讨其在宫颈病变过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年1 月～2019 年6 月江苏省镇江市第四人民医院（以下简称“我院”）的宫颈病变患者100 例为病例组，根据宫颈病变类型结果，分为慢性宫颈炎亚组（n=24），宫颈上皮内瘤变亚组（n=37），宫颈癌亚组（n=39）；根据人乳头瘤病毒（HPV）感染情况分为HPV 高危亚组（n=58），HPV 低危亚组（n=42）。同期随机选取65 例健康体检女性为对照组。病例组年龄23～76 岁，平均（45.23±8.75）岁；体重指数（BMI）22～27 kg/m2，平均（22.61±1.64）kg/m2；HPV 感染86 例；对照组年龄22～69 岁，平均（43.38±9.59）岁；BMI 21～26 kg/m2，平均（22.40±1.79）kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究对象及家属均签署知情同意书，且本研究经我院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①经病理活检证实存在宫颈病变；②首次确诊；③年龄≥18 岁；④临床病历资料完整。排除标准：①妊娠期以及哺乳期者；②心脏功能不全者及肝、肾功能障碍者；③伴有急慢性炎性反应疾病；④伴有自身免疫性疾病；⑤伴有精神疾病；⑥乳腺癌、卵巢癌等可能影响本研究结果的恶性肿瘤患者；⑦纳入研究前接受过药物或者手术治疗。

1.2 方法

对照组于体检当日抽取空腹肘静脉血6 mL，病例组于入院次日收集空腹肘静脉血6 mL。肝素钠抗凝后采用FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪（美国BD 公司）检测T 淋巴细胞亚群和调节性T 细胞水平。检测方法：肝素抗凝后的血液标本加入5 mL 流式管，分别将10 μL CD3、CD4、CD8 抗体［贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司提供，批号：161207］加入管中混匀，37℃避光孵育20 min；加入2 mL 1×红细胞裂解液,混匀，避光放置10 min，溶解红细胞；2000 r/min 离心10 min（离心半径为10 cm），取血浆；加入2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），重悬细胞，流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+），同时检测调节性T 细胞CD4+CD25+CD127-水平。CD4+CD25+CD127-试剂盒由贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司提供（批号：20161025）。本研究均在同一环境下、由同一名操作人员使用相同的仪器进行检测。

1.3 统计学方法

采用SAS 9.4 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；相关性分析采用Pearson 积聚相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较

病例组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于对照组，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

表1 两组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

2.2 不同宫颈病变类型亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较

宫颈上皮内瘤变亚组、宫颈癌亚组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于慢性宫颈炎组，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平高于慢性宫颈炎亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；宫颈癌亚组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于宫颈上皮内瘤变亚组，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平高于宫颈上皮内瘤变亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.3 不同HPV 感染亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较

HPV 高危亚组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于HPV 低危亚组，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平高于HPV 低危亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

2.4 Pearson 积矩相关分析

宫颈病变严重程度与CD3+（r=-0.617，P＜0.05）、CD4+（r=-0.592，P＜0.05）、CD4+/CD8+（r=-0.628，P＜0.05）呈负相关，与CD8+（r=0.603，P＜0.05）、CD4+CD25+CD127-（r=0.624，P＜0.05）呈正相关。

表2 不同宫颈宫颈病变类型亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

表2 不同宫颈宫颈病变类型亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

注：与慢性宫颈炎亚组比较，*P＜0.05；与宫颈上皮内瘤变亚组比较，#P＜0.05

表3 不同HPV 感染亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

表3 不同HPV 感染亚组外周血T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞水平比较（±s）

注：HPV：人乳头瘤病毒

3 讨论

宫颈病变是女性生殖系统常见疾病，严重者可发展为宫颈癌，早期筛查有助于及时发现宫颈病变并预防宫颈癌［6-9］的发生。临床主要通过阴道镜联合宫颈组织病理活检、膜式液基薄层细胞学、第二代基因杂交捕获技术等手段发现宫颈上皮内瘤变，进一步评估宫颈癌的发生风险［10］。但其适用人群不同，且费用相对较高，患者依从性较低。研究显示［11-12］，免疫功能低下贯穿宫颈病变的整个环节，也是导致宫颈癌发生的重要原因。T 淋巴细胞是具有免疫功能的淋巴细胞，通过细胞之间的接触、竞争性抑制、分泌抑制性细胞因子等方式，维持机体免疫稳定及调控免疫应答，同时还能直接杀伤靶细胞，抑制T 细胞活化，避免机体免疫系统识别和破坏肿瘤细胞，最终促使机体耐受肿瘤细胞［13-15］。T 淋巴细胞免疫功能失调或者免疫抑制可导致肿瘤细胞免疫逃逸，促进恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移［16］。调节性T 淋巴细胞主要在胸腺中发育成熟，经诱导形成有免疫调节功能的T 淋巴细胞。研究显示［17］，调节性T 淋巴细胞可抑制CD4+、CD8+亚群的增殖反应，负向调控自然杀伤（NK）细胞的免疫效应，并使肿瘤细胞发生免疫逃逸而促进恶性肿瘤细胞的发生和发展。

T 淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的比例与细胞免疫反应密切相关，正常生理状态下两大亚群比例在一定范围内波动，维持机体的免疫系统平衡，一旦机体出现免疫功能紊乱，其比例呈异常改变；CD4+CD25+CD127-主要反映调节性T 细胞在机体的免疫抑制功能，其水平升高可抑制T 淋巴细胞亚群的效应［12,18］。本研究发现，与对照组比较，病例组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平显著降低，CD8+水平升高，提示宫颈病变患者细胞免疫功能紊乱，T 淋巴细胞亚群表达异常，可能是由于宫颈病变破坏机体的免疫功能，减少T 淋巴细胞总群和亚群的比例，与王金生等［11］的研究结果相似。此外，病例组CD4+CD25+CD127-水平高于对照组，可能是因为调节性T 细胞可分泌促炎因子如白细胞介素（IL）-10、转化生长因子-β（TGF-β）发挥免疫抑制效应，同时还能直接抑制T 细胞活化，发挥负向免疫调控功能。本结果还显示，随着宫颈病变程度的加重，外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平趋于下降，CD8+水平趋于升高，提示随着病情不断进展，患者免疫功能失衡程度加重，直至引发宫颈癌。同时，随着宫颈病变程度加剧，CD4+CD25+CD127-水平逐渐升高，提示免疫抑制效应增强，免疫功能降低，促进宫颈癌的发生和发展。上述结果说明，T 淋巴细胞亚群和调节性T 细胞亚群相互作用，形成免疫逃逸现象，进一步促进恶性肿瘤形成［19］。

HPV 感染是导致宫颈癌的独立危险因素，本研究结果显示，HPV 高危亚组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平比HPV 低危亚组更低，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平相对升高，提示HPV 感染高危患者更易存在免疫功能紊乱现象。有研究显示［20］，免疫功能正常的女性HPV感染可在一段时期内痊愈，而免疫功能低下的HPV感染女性极易发生宫颈病变，增加宫颈癌的发生风险。故针对HPV 感染者，尤其需要关注免疫功能情况，通过评估免疫功能在临床采取相应的干预手段，减少宫颈病变的持续恶变及预防宫颈癌发生。本研究有14 例患者未检出HPV，可能是因为HPV 已被机体清除，或者该部分患者恶性肿瘤的发生发展与其他病原体感染有关，或是其他罕见的宫颈病变［21］，将在下一步研究这类特殊群体。经Pearson 积矩相关分析发现，宫颈病变的严重程度与T 淋巴细胞亚群、调节性T 细胞密切相关，提示早期检测细胞免疫功能相关指标可辅助临床评估宫颈病变的严重程度。T 淋巴细胞亚群失衡越严重，免疫功能紊乱越显著，调节性T 细胞分泌的抑制性细胞因子分泌增加，两者共同作用加重宫颈病变。

综上所述，T 淋巴细胞亚群和调节性T 细胞表达异常参与了宫颈病变的发病过程，并且与病变严重程度密切相关，早期检测可辅助临床评估宫颈病变的情况。本研究选取样本量相对较小，且为单中心回顾性研究，建议下一步开展多中心前瞻性队列研究，深入探讨T 淋巴细胞亚群和调节性T 细胞表达水平在宫颈癌发病过程中的作用。