口腔鳞状细胞癌中MAPK8基因的表达及意义

崔宇平 马洪 段晓峰

据统计，世界上常见的癌症之一就是口腔癌，全球平均每年临床上确诊的发病人数约500～600 万人，主要以发展中国家及欠发达地区人群为主要的患病群体，晚期口腔癌的患者5 年存活率约为10%～30%)[1-2]，在中国， 10 万名癌症患者中口腔癌的发病率大约在3.6～8.0 万人之间。相关研究表明，口腔癌基因被激活并发展是由多种因素、多种环境共同参与产生的结果[3]。近年来，细丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)基因在人体的多个部位的肿瘤组织中均呈现高表达的状态，比如肝癌，胃癌，胰腺癌等等。本研究利用Real Time PCR方法及免疫组织化学技术检测MAPK8 mRNA分别在正常口腔黏膜组织及口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达情况，并探讨在不同临床表现的OSCC病例中MAPK8mRNA的表达差异，为OSCC的早期诊断提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 标本来源

标本来自贵州医科大学附属医院及贵州省肿瘤医院的口腔颌面外科手术过程中进行切除的口腔组织，所有采集标本患者的年龄均大于18 周岁，患者术前检查均无全身系统性疾病;在自拔牙患者口腔中采集正常黏膜组织。所有42 例OSCC组织及17 例正常组织,离体后等分成2 份，其中一块立即用RNA later液暂封, 4 ℃冰箱过夜， -80 ℃冰箱保存，另外一块组织放入装有4%甲醛溶液的玻璃瓶里，浸泡在液体内部，常温保存待用。收集时间 2016-06～2017-01。

1.2 引物合成

根据参考文献确定内参基因序列及引物[4]。MAPK8，上游序列：gggcagccctctccttta；下游序列：cattgacagacgacgatgatg。内参基因GAPDH，上游序列：cttagcacccctggccaag；下游序列: gatgttctggagagccccg。

1.3 主要试剂与方法

1.3.1 Real-time PCR 取3 mm×3 mm左右体积的组织，利用磁珠法提取mRNA, 使用美国Roche公司的Dynabeads Rm-RNA DIRECTTM试剂盒，再利用Roche的Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行逆转录操作，然后进行扩增操作，利用10 μl反应体系:上下游引物4.0 μl,模板1 μl。预变性95 ℃, 1 min;变性95 ℃, 10 s; 退火65 ℃, 30 s, 共64 个循环。每个样品7 个复孔,取CT平均值,采用 2-△△CT法进行结果分析。

1.3.2 免疫组织化学染色SP法 常规甲醛溶液进行固定后进行组织蜡块连续切片，按照SP免疫组化二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行染色。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 RT-PCR结果分析

OSCC患者与口腔正常黏膜组织患者的相对表达量分别为: 0.040 3±0.027 5和1.308 7±0.734 5,t=11.172,P<0.05。其中OSCC组织中,不同临床特征间比较结果如表 1所示。

2.2 免疫组织化学染色结果分析

正常口腔黏膜组织中未见明显黄染，OSCC组织中MAPK8阳性着色主要位于细胞质(图 1A～1C)，在高分化OSCC组织中，可见细胞质黄染，细胞核未见明显着色，在中低分化OSCC组织中，细胞质黄染程度略微高于高分化OSCC组织，细胞核略微着淡黄色。由病理科医生在双盲条件下，在镜下随机取10 个阳性视野，用平均光密度法(Mean Optical Density，MOD)来分析染色结果。免疫组织化学检测MAPK8基因的表达情况见下表 2～3。

表 1 MAPK8 mRNA在OSCC中不同临床特征的相对表达量Tab 1 Association between MAPK8 mRNA expression and clinical characteristics of OSCC

图 1 MAPK8蛋白质在正常口腔黏膜和OSCC中的表达(SP，×200)Fig 1 MAPK8 protein expression in normal oral mucosa tissues and OSCC(SP，×200)

表 2 MAPK8蛋白在OSCC及正常黏膜组织中的表达Tab 2 The expression of MAPK8 protein in the normal oral mucosa tissues and OSCC

3 讨 论

MAPK家族信号通路是一种将外界的刺激或者信号通过一系列的反应使通路激活， 从而传导信号致细胞核内，使某个基因在转录过程中提高活性，进一步生成相应的蛋白质[5]，MAPK家族信号通路有蛋白激酶、c-JunN端激酶(JNK)等途径，不同的刺激因素激活MAPK信号通路从而形成不同的传导通路，进一步激活相应的转录因子，介导后续的生物学效应。最初在细胞核内发现转录因子c-Jun， MAPK8对其有特异性磷酸化的作用， 是c-Jun的激酶， 所以又把MAPK8称作c-Jun氨基末端激酶，当某种刺激因素激活MAPK8信号通路后，使MAP3ks活化，进一步激活MKK4，从而使MAPK8磷酸化，磷酸化后的MAPK8和细胞核内的转录因子ATF2相结合，结合以后活化的MAPK8使与之结合的转录因子的活性区域发生磷酸化，这样就可以和基因启动子上的AP-1结合，提高其转录活性，促进该基因的表达[6-7]，其功能涉及细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等各种机制。相关研究表明，MAPK8信号通路与肿瘤细胞的发生发展关系密切，通过磷酸化肿瘤细胞核内的丝氨酸/苏氨酸位点[8]，使其转录活性增强，使肿瘤细胞继续向恶性的程度继续发展。

表 3 MAPK8蛋白在OSCC中与不同临床特征之间的关系Tab 3 Relationship among the clinio-pathologic data with the expression of MAPK8 protein in OSCC

对本次实验MAPK8免疫组化和MAPK8mRNA相对表达量结果进行分析分析， qPCR和免疫组化结果均一致，结果显示相对于正常的口腔黏膜组织，在口腔鳞状细胞癌组织中MAPK8 mRNA的相对表达量和免疫组化MOD值明显较高，根据其致癌机制分析，可能是某种刺激因素激活MAPK8信号通路，使活化的MAPK8与癌基因的转录因子结合并且提高其转录活性，进一步使癌细胞进行增殖与分化。本次实验也研究了MAPK8基因在OSCC中不同临床特性的关系，在性别的分组中，从分子水平和蛋白水平来看，男性和女性均有差异，但是差异没有统计学意义，可能说明对于OSCC组织的增殖与分化，性别导致的分泌激素水平的差异对其影响较小，同样，在对于大于60 岁和小于60 岁的分组研究中，结果虽然有差异，但是也没有统计学意义，在分化状态的分组中，随着口腔鳞癌组织分化程度的降低，MAPK8 mRNA的相对表达量呈现逐渐增加的趋势，在免疫组化的研究中，分化状态越低，黄染的程度越强。在对OSCC组织进行临床分期研究的结果表明，随着临床分期的变晚，MAPK8的表达量越高，后两组统计学结果均有意义，此结果提示MAPK8基因相对表达量的增高对早期口腔黏膜病变和口腔恶性肿瘤患者的预后推断具有一定意义。MAPK8在OSCC组织中的研究未见相关性的报告，李国东等[9]对于人骨肉瘤的研究指出MAPK8通路被激活以后进而磷酸化下游的c-Jun，从而调节细胞侵袭和转移相关基因例如uPA和MMPs等的表达，提高细胞的侵袭能力，还有MAPK8通路在各类其他的研究中例如乳腺癌[10]、结肠癌等[11]组织中都有不同程度的MAPK8表达量的增高，其致癌机制均是MAPK8通路先被外界刺激因素激活，转至细胞核内提高转录因子的活性，进一步使癌细胞增殖和分化，和上述文章内所陈述的致癌机制一致。

综上所述，MAPK8基因在OSCC组织中高表达，并且随着分化程度越低，临床分期越晚，MAPK8基因的表达含量越高，所以检测口腔黏膜MAPK8基因的表达量可以对口腔黏膜的早期病变进行诊断或者预防，同时，MAPK8是否作为口腔鳞状细胞癌的靶向治疗仍需要进一步的研究。