几种中药提取液对常见的致病菌体外抑菌及抗氧化活性的初步研究

历雪，夏青，李艳，赵凤胜，何秀霞

（1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.长春理工大学 校医院，长春 130022）

食源性疾病[1-2]已经对人类的健康带来了严重的危害[3]，而全世界所有食源性疾病暴发案例中，有60%以上为细菌性致病菌污染食物所致的，食品的细菌污染是指暴露于环境中的食品通过不同途径被细菌污染，在细菌作用下腐败变质，失去其应有的营养成分，从而影响其食用性和安全性的现象。人们在食用了被有害细菌污染的食品后，会发生各种中毒现象，同时细菌污染是最常见的食品污染之一。大肠杆菌[4]和金黄色葡萄球菌[5]是最容易感染食品的病原菌，当其含量过高时会造成食物中毒，严重的时也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症，与此同时金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也极容易感染伤口，引起局部化脓感染，严重的情况下会造成脓毒症等全身感染。而沙门氏菌[6]和粘质沙雷氏菌[7]广泛存在于动、植物性等其他食品中，据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌是会引起食物腐败造成食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌，而人体摄入粘质沙雷氏菌后，当机体免疫功能降低时，则会引起肺部和尿道感染以及败血症，因此选取这四种病原菌作为指示菌对于实验研究是十分必要的。

而目前食品行业普遍采用化学防腐剂来对食品和肉类进行抗菌与防腐，众所周知，化学防腐剂虽然有一定的抗菌和防腐的作用，但是其诱癌性与致畸性对人类健康也存在潜在的危害[8]，因此开发出高效、安全、稳定的天然防腐抗菌剂[9-11]已经成为新型防腐剂研究的重要方向。我国药典中记录了4773种中草药，其中研究发现有2000多种具有抑菌作用[12]，因此中药成为了天然抗菌防腐剂的最佳资源。黄连[13-14]、迷迭香[15-16]、大蒜[17-18]在以往的文献报道中都具有良好的抗菌效果，而独角莲[19]虽然有一定的毒性，但是含量较少的时候并不会造成严重的影响，而市面销售的抗菌药膏也有独角莲成分的添加，因此本文也选用独角莲作为药物之一。但是中草药的种类繁多，不同的中草药对同一种微生物的抑制作用也不同，本文研究了4种中草药对常见的致病菌的抑制作用以及抗氧化活性，并在此基础上进行两两混合，以研究两种中草药之间是否存在促进作用，同时这也对开发天然抗菌防腐剂以及制备抗菌生态乳膏具有一定的意义。

1 实验

1.1 材料

中药：黄连、迷迭香、独角莲（吉林大药房）、大蒜（市售）

菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌（来自于长春理工大学生命科学技术学院微生物实验室）

药品与仪器：山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸丙酯（上海生工）、DPPH（美国SIGMA公司）、牛肉膏、蛋白胨（英国OXOID公司）、752型紫外可见分光光度计（上海奥析科学有限公司）、细胞超声破碎仪（上海安亭科学仪器）

1.2 中药提取液的制备

将购买的黄连、独角莲、迷迭香，剪碎研磨，过40目筛板后，准确称取50g，置于烧杯中，加入500mL 80%乙醇浸泡24h，超声破碎30min，在4℃、12000r/min的条件下离心20min，取上清液。将沉淀收集起来，重复上述操作。将两次得到的液体相加。将滤液在60℃条件下蒸发，浓缩至25mL。用滤器过滤除菌，即制得黄连、独角莲、迷迭香的提取液，置于4℃冰箱备用。

准确称量200g大蒜，去皮，置于榨汁机，往榨汁机中加入400mL蒸馏水，压榨成汁静置48h。超声破碎30min，在4℃、12000r/min的条件下离心20min，取上清液。将上清液于60℃条件下进行蒸发，浓缩到100mL，收集浓缩液，用滤器过滤除菌即得大蒜的提取液，置于4℃冰箱备用。以上中药提物液，浓度均为2g/mL。

1.3 滤纸片法测定抑菌圈大小

参照滤纸片法[20-22]使用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，灭菌后备用。夹取充分浸泡后的滤纸片贴在含菌平板上（含有乙醇的滤纸片晾干后使用），每个平板均匀贴3-4片，倒置于恒温培养箱中进行培养，然后测量抑菌圈的大小，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、粘质沙雷氏菌作为供试菌种进行抑菌实验。

1.4 二倍稀释法测定最小抑菌浓度

采用二倍稀释法[23-24]，将中药提物液稀释成10个梯度，稀释后的浓度为：1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、 0.125g/mL、 0.0625g/mL、 0.03125g/mL、0.0156g/mL、0.0078g/mL、0.0039g/mL、0.00195g/mL然后方法同前，采用金黄色葡萄球菌作为指示菌进行抑菌试验。

1.5 不同中草药提取物两两混合后抑菌圈大小的测定

将大蒜、迷迭香、黄连和独角莲提取液等比例两两混合，得到大蒜和黄连混合物（大+黄）、大蒜和迷迭香混合物（大+迷）、大蒜和独角莲混合物（大+独）、迷迭香和黄连混合物（迷+黄）、迷迭香和独角莲混合物（迷+独）、黄连和独角莲的混合物（黄+独），同样采用金黄色葡萄球菌作为指示菌进行抑菌试验。

1.6 与常见的防腐剂进行比较

目前，我国食品中添加的防腐剂[25-26]主要为苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯。参照国家食品添加剂使用标准的相关规定配制这两种溶液。取适量的黄连、独角莲、迷迭香、大蒜的提取液用滤纸片法测定对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，方法同前，并与防腐剂的抑菌效果进行对比。

1.7 DPPH法测定中药提取物的抗氧化活性

DPPH[27-28]溶液的配制：准确称量0.004g DPPH粉末，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，DPPH浓度为1mmoL/mL，避光保存（4℃），现用现配。

（1）取中药提物液1mL及浓度为0.1mmoL/mL的DPPH溶液3mL先后加入同一具塞试管中，摇匀，在3500r/min下离心20min，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Ai。

（2）取3mL 0.1mmoL/mL的DPPH溶液与1mL甲醇混合，摇匀，在3500r/min下离心20min，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Ao。

（3）取1mL大蒜水提物与3mL甲醇混合，摇匀，在3500r/min下离心20min，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Aj。根据下列公式计算植物提取液对DPPH的抑制率，即：

式中，Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；Ao为加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Aj为重要提取液在测定波长的吸光度。

（4）测度清除率并绘制清除率与样品浓度曲线，通过曲线计算出IC50。IC50是指DPPH的抑制率为50%时的提取物溶液浓度。IC50越小，抗氧化能力越强。将试验重复3次，求得抑制率的平均值。

2 结果与讨论

2.1 中药提取液对4种常见的病原菌的抑制作用

表1 几种药物（2g/mL）抑菌圈直径大小

结果如表1显示，独角莲对这4种病原菌均无抑制作用，黄连、迷迭香和大蒜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有一定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的作用明显更强，只有黄连对粘质沙雷氏菌有抑制作用。

2.2 MIC的测定

表2 几种药物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（mg/mL）

由于这几种中药提取液都对金黄色葡萄球菌的抑制效果更明显，且金黄色葡萄球菌非常常见，因此选取金黄色葡萄球菌作为指示菌，由表2可知，迷迭香的最小抑菌浓度为1.95mg/mL，其次为黄连3.9mg/mL、大蒜250mg/mL，因此不同的中药提取物对金黄色葡萄球菌的敏感性不同，金黄色葡萄球菌对迷迭香更敏感。

2.3 药物两两混合后对金黄色葡萄球菌的抑制作用

将中药提取液两两混合后，与原液进行抑菌圈大小的比较，由表3可知，发现了一个很有趣的现象，虽然独角莲没有抑菌效果，但是加入独角莲提取物后，黄连和迷迭香提取物与原液相比，抑菌的效果有了一定的提高，具体机制还需要进一步研究，而其他的则无明显效果，大蒜和其他几种中药的提取物混合后，其抑菌圈明显减小，主要原因两者没有促进作用，大蒜的浓度降低造成的。

表3 药物两两混合后对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.4 与常见的防腐剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用进行比较

由表4可知，除独角莲外的几种中药提取物与常见的防腐剂比较，对金黄色葡萄菌的抑制作用均优于防腐剂，其中大蒜和黄连的作用效果最强，由此可见黄连、迷迭香、大蒜均有作为天然防腐剂的潜力。

表4 几种药物与常见的防腐剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.5 中药提取物抗氧化活性IC50的测定

由表5可知，迷迭香和黄连对DPPH自由基的清除能更强，其抗氧化活性能力从大到小依次为：迷迭香、黄连、独角莲、大蒜。迷迭香的抗氧化能力最强，其IC50值为0.325mg/mL。

表5 几种药物的IC50值

3 结论

不同的中药提取液对不同的微生物有着不同的抑制作用和敏感性，研究发现黄连、大蒜、迷迭香对金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用，而其中的黄连和大蒜的抑制效果更明显，通过与常见的防腐剂比较以及抗氧化活性试验的研究，进一步确定了迷迭香、黄连、大蒜具有作为天然防腐剂的潜力，而通过两两混合药物的研究，发现独角莲对迷迭香和黄连的抑菌活性具有一定促进作用，这也为日后天然防腐剂以及抗菌的生态乳膏制备中成分的添加起到了一定作用。