不同品质浓香型窖泥理化因子与细菌总量的相关性

王艳丽，孟雅静，何宏魁，张会敏，刘国英，王录，刘露，李静心

(安徽古井贡酒股份有限公司，安徽 亳州，236800)

浓香型白酒的酿造过程是环境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等复杂物质能量代谢的过程[1]。通过发酵过程中产生的黄水的介导，窖泥与酒醅之间不断进行微生物和物质能量的交换，既为酒醅的发酵提供了丰富的微生物种群，又实现了窖泥自身的新陈代谢[2]。窖泥微生物经过长期的驯化和发展，慢慢形成了自身独特的微生物群落，其中主要的有益功能菌，有大量的是厌氧菌微生物，他们种类、数量繁多且复杂[3-5]。正是这些有益功能菌的大量生长、繁殖以及相互协调作用，才赋予了白酒独特的香型，造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒典型风格[6]。因此，浓香型白酒的品质与窖泥质量的优劣关系密切。

浓香型窖池中的窖泥是由特定的泥料在人工发酵培养后形成的，窖池泥经过长期、连续的生产，不断被驯化并慢慢趋于老熟，并最终形成对酒质的提高及稳定至关重要的优质老窖泥，正所谓“千年老窖，万年糟”和“酒好全凭窖池老”[7]。但是窖池经过几年的生产发酵，窖泥中原有的营养物质被微生物不断吸收和利用而逐渐减少，有害物质则不断积累，再加上养护措施不合理，于此同时，由其他多种因素导致的窖泥中以己酸菌为主体的有益功能菌的生长、繁殖受到限制，以及菌种的退化等原因，导致窖泥出现不同的退化、老化。最明显表现是窖壁泥起碱、变硬，窖池底部表面开始出现白色颗粒状(以乳酸钙为主)和针状(以乳酸亚铁为主)结晶，此时养护不及时，白色颗粒会逐渐发展为白色大块团状结晶物质，引起窖泥的老化板结。摘酒质量明显降级，表现为酒味虽纯正、醇和，但窖香不明显，主体风味物质己酸乙酯含量降低[8]。

本研究以退化窖池、正常新窖池和优质老窖为对象，深入分析其窖泥微生物、理化特性以及黄水与加浆水的理化特性方面的差异，旨在掲示各理化指标对窖池退化的影响，为窖池养护与预防退化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要材料

窖泥样品取自某酒厂退化窖泥、正常新窖泥和优质老窖泥[9]，每类样品各取3份(每份约400 g)，这3份窖泥分别采自不同窖池的3类窖泥样品。退化窖池和正常新窖池均为有5年窖龄的人工老窖窖池，优质老窖为30年窖龄的老窖池。

1.1.2 主要试剂

TIAGE土壤DNA提取试剂盒，质粒DNA提取试剂盒(生工生物工程有限公司)，TAKARATaq，TAKARA SYBR Fast QPCR Mix。

1.1.3 仪器与设备

TU-1901/UV-9000紫外-可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；Piko Real荧光定量PCR仪，美国赛默飞世尔科技公司；G-26C高速冷冻离心机，德国赛多利斯；MN-913超微量核酸检测仪，美国MaestroGen公司。

1.2 试验方法

1.2.1 窖泥取样方法

窖池窖底中心和4个角各取一点，在无菌袋中混匀后分成2份，分别置于4 ℃冰箱(测窖泥理化指标)和-80 ℃冰箱(窖泥DNA提取)。

1.2.2 窖泥处理

窖泥取回后，置于室内自然风干，磨成粉末后，60目过筛，保存、备用。

1.2.3 窖泥微生物定量方法

取0.25 g新鲜窖泥样品，进行DNA提取后加入70 μL无菌水洗脱，取1 μL DNA模板，采用341F5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和517R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGC-3’为引物扩增细菌16S rDNA基因V3可变区，扩增片段约177 bp左右，再通过标准曲线计算得到每个窖泥样品细菌的拷贝数，具体方法参考文献[10]。

1.2.4 窖泥理化分析方法

水分测定：烘干法[11]；pH值：电位法[12]；腐殖质：重铬酸钾氧化法[13]；铵态氮：紫外-可见光分光光度法测定[13]；有效磷含量：氟化氨-盐酸提取法[14]；有效钾[15]、窖泥铁测定：紫外-可见光分光光度法[16]；窖泥钙、镁测定：EDTA滴定法。

1.2.5 数据分析

数据分析采用Origin 8.5、SAS 9.0、SPSS 22和R语言软件进行数据处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 不同质量等级窖泥理化因子的差异

2.1.1 不同质量等级窖泥样品的水分含量和pH值的差异

水分和pH值在浓香型白酒酿造过程中起着重要的作用，水分含量过高会导致窖泥挂壁难甚至垮窖，水分缺失又会导致窖泥板结，盐类析出，窖泥中部分微生物死亡最终导致窖泥老化[17]，窖泥中微生物的生长繁殖和代谢受窖池酸度的影响较大，严重影响生产，因此对窖泥中水分和pH值的监测至关重要。

本试验研究了不同质量等级窖泥间水分含量和pH值的差异，如图1所示。优质窖泥、正常新窖泥和退化窖泥不同质量等级间水分含量差异显著(P<0.05)，其中优质窖泥水分含量显著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥水分含量显著高于退化窖泥(P<0.05)。而优质窖泥、正常新窖泥和退化窖泥不同质量等级间pH值差异不显著(P>0.05)。

图1 不同质量等级窖池窖泥水分含量和pH值的差异
Fig.1 Difference of water content and pH value of pits
with different quality grades
注：水分含量和pH值含量差异显著性分别用大写和小写英文
字母来表示，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.2 不同质量等级窖泥样品的铵态氮和腐殖质含量的差异

铵态氮是有机质经微生物分解而形成的，以盐的形式存在，可以被窖泥微生物直接利用，其含量高低在一定程度上体现了窖泥对微生物生长代谢所需氮元素的供给能力[18]。腐殖酸是窖泥中重要的有机质[19]，腐殖质的重要组成部分，是由微生物代谢物日积月累而形成，在土壤学中，其含量能够反应窖泥肥力。有研究表明[20]，腐殖酸是窖泥成熟的重要标志，其含量随着窖龄的增加而升高。

本试验研究了不同质量等级窖泥间铵态氮和腐殖质含量的差异。如图2所示。

图2 不同质量等级窖池窖泥铵态氮和腐殖质含量的
差异
Fig.2 Differences in the content of ammonium nitrogen and
humus in pits of pits with different quality grades
注：铵态氮和腐殖质含量差异显著性分别用大写和小写英文
字母来表示，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

铵态氮含量优质窖泥、正常新窖泥和退化窖泥之间差异显著，其中优质窖泥显著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥又显著高于退化窖泥(P<0.05)。

优质窖泥的腐殖质含量显著高于正常新窖泥和退化窖泥(P<0.05)，但正常新窖泥和退化窖泥间腐殖质含量差异不显著(P>0.05)。

2.1.3 不同质量等级窖泥样品的有效磷和有效钾含量的差异

有效磷是水溶性的和有机态的易被微生物直接吸收利用的磷，是微生物生长代谢必不可少的元素。研究表明有效磷含量与土壤中微生物生物量及代谢呈正相关关系[21]。

本试验研究了不同质量等级窖泥间有效磷和有效钾含量的差异，如图3所示。优质窖泥有效磷和有效钾含量的都显著高于正常新窖泥和退化窖泥(P<0.05)，正常新窖泥与退化窖泥之间有效磷和有效钾含量差异都不显著(P>0.05)。

图3 不同质量窖池窖泥有效磷和有效钾含量的差异
Fig.3 Differences of effective phosphorus and effective
potassium content in pits with different quality grades
注：有效磷和有效钾含量差异显著性分别用大写和小写英文
字母来表示，有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，无相同
字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.4 不同质量等级窖泥样品的钙和镁含量的差异

微生物的生长、繁殖离不开各种矿物质元素，并与各种矿物质元素之间存在着多种循环代谢和信息传递的关系，这些矿物质元素也是窖泥微生态系统的重要组成部分。但是当窖泥中钙、镁等矿物质元素含量过高、水分缺失时就会与窖池中的酸类作用形成晶体析出，造成窖泥退化、酒质和产量降低的现象，对整个生产造成严重的影响，因此对窖泥中的钙、镁含量进行监测具有重要作用。

本试验研究了不同质量等级窖泥间钙和镁含量的差异，如图4所示。退化窖泥钙含量显著高于优质窖泥和正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥钙含量又显著高于优质窖泥(P<0.05)。而镁含量在退化窖泥、正常新窖泥和优质窖泥不同质量等级之间差异都不显著(P>0.05)。

图4 不同质量等级窖池窖泥钙和镁含量的差异
Fig.4 Differences of calcium and magnesium content in pits
with different quality grades
注：钙和镁含量差异显著性分别用大写和小写英文字母来表示，
有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，无相同字母表示差异
显著(P<0.05)。

2.1.5 不同质量等级窖泥样品的铁含量的差异

铁是土壤中的微量元素，它主要是给微生物提供微量营养成分，以及参与多种生化反应(或作为催化剂)，铁在土壤中主要来源有：氧化物、硫化物和它们的水解离子，而它对土壤及生物的作用并不是它的总量，而是它的有效态含量和由转化条件决定。在酿酒生产中，常有窖泥老化现象：窖泥表面盐碱化，板结而坚硬，含水量少，透水性能逐步降低，并由表及里发展。老化窖泥与优质老窖的土壤成分最大差异在于窖泥中铁元素的存在形态。铁在窖泥不同氧化还原电位下，呈现不同的形态。当窖泥处于中度还原电位时，受糟醅淋浆、pH等因素的影响，活性铁大量积累，主要以乳酸亚铁为主。乳酸亚铁的积累和结晶，对窖泥微生物产生毒害作用，使窖泥失去产香功能，进而老化[22]。

本试验研究了不同质量等级窖泥间铁含量的差异。如图5所示：退化窖泥、正常新窖泥、优质窖泥3者之间的铁含量均呈显著性差异(P<0.05)，且退化窖泥的铁含量显著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥的铁含量显著高于优质窖泥(P<0.05)。

图5 不同质量等级窖池窖泥铁含量的差异
Fig.5 Differences of iron content in pits with different
quality grades
注：铁含量差异显著性用大写英文字母来表示，有相同字母
表示差异不显著(P>0.05)，无相同字母表示差异显著
(P<0.05)。

2.1.6 窖泥理化指标主成分分析

对退化窖泥(C1、C2、C3)、新窖泥(B1、B2、B3)和优质老窖泥(A1、A2、A3)中水分、铵态氮、腐殖质、有效钾、有效磷、pH值、镁、铁和钙进行PCA分析，结果如图6所示，PCA分析结果表明窖泥理化因子与窖泥质量呈现明显的相关性。不同质量的窖泥能很好的聚成3类，即优质窖泥、新窖泥及退化窖泥。这也表明,利用窖泥理化指标判定和预测窖泥的质量是可行的。

图6 主成分分析结果
Fig.6 Result of principal component analysis (PCA)

2.2 窖泥理化指标和细菌总量参数比较分析

如表1所示，退化、正常新窖及优质窖泥样品中水分、铵态氮、钙和铁含量均表现出显著性差异(P<0.05)。其中退化窖泥中的钙和铁含量分别是正常及优质窖泥中的1.90～6.65和6.56～24.95倍，而其他理化指标均低于正常及优质窖泥中相应理化指标。

表1 退化、新窖泥及优质窖泥中理化指标和细菌总量参数比较分析表(平均值±标准偏差，n=3)Table 1 Biogeochemical attributes (means±standard deviation, n=4) in degraded, normal and high-quality FPMs

注：每行不同字母(a、b和c)表示不同质量窖泥理化指标和细菌总量的差异性(P<0.05)。

退化与正常窖泥相比，pH、腐殖质、有效磷、有效钾、镁和细菌总量均无明显差异(P>0.05)。正常与优质窖泥相比，除镁含量指标外其他指标均存在明显差异(P<0.05)。

2.3 窖泥理化数值和细菌总量相关性研究

任何环境或发酵体系中的微生物都受制于其周围理化因子的影响，这也是微生物在窖泥中不断被驯化、富集及淘汰的理论基础[9]。因此，研究窖池环境因子与微生物总量的相关性有助于分析窖池退化因子，并制定相应的策略去养护窖泥中的微生物。关于窖泥中理化因子许多白酒厂都进行了相关研究[23-25]。本研究尝试从窖泥内部理化因子之间的关系变化以及与细菌总量之间的相关性来分析窖泥退化的可能原因。本研究使用统计学上的相关性系数公式计算窖泥理化因子、细菌总量之间的相关性系数，相关系数在-1～1，负数表示负相关，正数表示正相关，绝对值越大相关性越强[26]。结果如图7所示，窖泥细菌总量与铵态氮、有效磷、腐殖质、水分、有效钾和pH的相关系数呈正相关，其中铵态氮、有效磷和有效钾正相关影响强度最大，说明营养物质是微生物赖以生存的基础，在任何环境下影响都最大，而水分和pH值对环境微生物生长影响也较大，是微生物生命活动的基本条件之一，所选环境因子对窖泥细菌总量正相关影响，依次为铵态氮、有效磷、有效钾、水分、腐殖质和pH值。而窖泥细菌总量与镁、钙和铁含量呈明显负相关，特别是钙和铁与窖泥细菌负相关性很强，这也说明钙和铁作为窖池退化的指标，是由于其含量的增加严重影响了窖泥微生物的生长，从而引起的窖池窖泥结晶甚至板结退化，镁含量对窖泥细菌总量也存在一定的负相关，说明镁含量的增加不利于窖泥微生物的生长。因此在窖池养护过程中要注意监控窖泥镁、钙和铁含量的变化。

图7 窖泥理化与细菌总量相关系数分析结果
Fig.7 Correlation analysis results of the total amount of
bacteria and biogeochemical properties in the pits

3 结论

(1)对不同质量等级窖泥的理化指标进行差异性比较分析，发现各等级间水分、铵态氮、钙和铁含量均表现出显著性差异(P<0.05)，特别是退化窖泥中的钙和铁含量显著高于正常及优质窖泥，而水分和铵态氮含量均低于正常及优质窖泥，因此可以推测窖泥退化是由于窖泥中的钙、铁含量大量积累，从而影响了窖泥中水分和铵态氮含量的降低。退化与正常窖泥相比，pH、腐殖质、有效磷、有效钾、镁和细菌总量均无明显差异(P>0.05)，说明这几个理化指标是间接性造成窖泥退化的因子。除镁含量外，正常与优质窖泥相比其他各理化指标均存在明显差异(P<0.05)，说明窖泥理化因子与窖泥质量呈现明显的相关性，新窖在向老窖转变的过程中窖泥各环境因子也在发生明显变化。

(2)铵态氮和有效磷、腐殖质、水分、有效钾和pH对窖泥细菌总量呈正相关影响，而镁、钙和铁含量对窖泥细菌总量呈明显负相关影响，说明窖泥理化因子是影响窖泥微生物生长的主要因素，也是反映窖池退化的重要指标，镁、钙和铁在适量的情况下对窖泥微生物生长有益，过量与窖泥退化有直接的关系，同时也对窖泥微生物的生长造成不利的影响。