水解胶原蛋白分子量控制技术的研究

石金扣

摘 要：在铬革屑中具有较多的胶原蛋白，因此通过合理的手段在铬革屑中进行胶原蛋白的提取，并进行有效的利用，是合理应用制革废屑的有效途径之一。当前阶段可通过在铬革屑中进行胶原蛋白的提取，制作成医用胶原蛋白。

关键词：胶原蛋白；实验仪器；分子量控制

1 胶原蛋白结构

在自然界中最为丰富的一种蛋白质便是胶原蛋白，是一种呈白色的纤维性质的生物高分子物质。动物机体的各个组织中均含有胶原蛋白，如动物皮肤、骨骼和韧带等部位，具有一定的结构型和力学性质，因此在动物生命活动中，胶原带白发挥了自身的重要作用。当前阶段经过相关的研究已发现十九种以上的胶原蛋白，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的胶原蛋白时最为常见的胶原带白类型，生皮中的胶原蛋白则主要为Ⅰ、Ⅲ型。其中在生皮中含量最丰富的便是Ⅰ型胶原蛋白，在其基本结构中的三股螺旋结构主要是由三条α多肽链构成的，且每条α肽链均为左手的螺旋构型。三条具有一定独立性的左手螺旋肽链通过互相缠绕的方式形成右手螺旋的结构，也就是胶原蛋白的三股螺旋结构。该螺旋结构具有一定的特殊性，并和二硫键、氢键等相互作用，从而使胶原带白所具有的机械强度得到了一定的保障。

2 水解胶原蛋白分子量控制的研究

2.1 实验仪器和材料

（1）实验仪器。本次实验选择的是北京华阳利民有限公司生产的型号为CL1030的毛细管电泳仪，美国安捷伦公司生产的液相色谱仪、江苏荣华仪器制造有效公司生产的水浴恒温振荡器、上海精密科学仪器有限公司生产的数显PH计、北京普析通用仪器有限责任公司生产的分光光度计、昆山市超声仪器有限公司生产的超声波清洗机、上海贝凯生物化工设备有限公司生产的恒温浴锅、北京雅士林试验设备有限公司生产的电热恒温鼓风干燥箱以及日本生产的电子分析天平。

（2）实验材料。本次实验所使用的主要材料为河北东明实业集团生产的铬鞣铬屑。所使用的实验试剂有北京化工厂生产的氢氧化钠、氧化镁、氢氧化钙、浓度为98%的硫酸、以及盐酸，北京化工试剂有限公司生产的氧化钙，西陇化工股份有限公司生产的四硼酸钠，以上作为分析纯。北京奥博星生物技术有限责任公司生产的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，以及西陇化工股份有限公司生产的低分子量的标准蛋白质和超低分子量的蛋白质共同作为生化试剂。

2.2 实验方法

（1）铬革屑的理化性质。首先测定其中的灰分，烘干胶原蛋白溶液，并对其总固体的重量进行测定，通过电炉进行碳化，之后通过马弗炉进行灰化。对灰化后的重量进行测量，其在总固体重量中所占的百分比，即为灰分的含量。之后测定铬的含量，将试样进行灰化，之后在熔融的状态下，即温度为400摄氏度的条件下，通过氯酸钾实现三价铬到六价铬的氧化。在高温条件下会将过多余的氯酸钾分家，之后通过分光光度法进行六价铬含量的测定。然后测定其中的水分，此时应按照国家相关的标准法烘箱法进行。最后测量其PH值，可对革试样的浸出液的PH值进行测定，将其作为革的PH值。

（2）胶原蛋白的提取。可通过以下几种方法对其中的较胶原蛋白进行提取：其一便是通过碱法水解对胶原蛋白进行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入浓度为6%的碱剂，并在85摄氏度的环境下进行5个小时的水解。冷却水解后的溶液并进行过滤，获取具有一定粘稠性的水解胶原液，将其烘干获得胶原蛋白粉末。其二便是通过碱酶法水解对胶原蛋白进行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入浓度为4%的碱剂，之后在80摄氏度的环境下，在水浴恒温振荡器内进行3个小时的水解。水解后将温度降到适合酶的温度，然后将碱剂、硫酸加入进去，将PH至调节到适合酶的PH值。将0.05克的酶加入进去，并进行1个小时的反应。水解溶液冷却后进行过滤，获取具有粘稠性的水解胶原液，将其烘干获得胶原蛋白粉末。其三便是通过酸法进行胶原蛋白的提取，取出10克的革屑粉碎后向其加入约为0.3毫升的硫酸或0.8毫升的草酸，在80摄氏度的环境下，在水浴恒温振荡器中进行2个小时的水解。完成反应后将氧化钙加入，从而对反应液的PH值进行调节。通过高温进行加入直至蓝色溶液转变为淡黄色溶液，并出现浅蓝色的沉淀。水解液冷却后进行过滤，将获取的具有粘稠性的水解胶原液进行烘干，从而获得胶原蛋白粉末。其四便是通过酸酶水解法进行胶原蛋白的提取，向粉碎的10g革屑中加入0.2ml的硫酸（或0.7g的草酸），80°C下在水浴恒温振荡器中水解2h，将温度降至酶的最适温度，加入NaOH或相应的酸（硫酸（98%）、草酸）调反应液的pH至酶的最适pH，加入0.1g的酸性蛋白酶反应1h。反应完之后，加入Ca（OH）2调节反应液的pH值在10左右，高温加热，直到蓝色的溶液变为淡黄色，并且有浅蓝色沉淀为止。将水解液冷却过滤，得到粘稠的水解胶原液，烘干，得到胶原蛋白粉末。还需要对提取率进行测定，提取率表明革屑的水解程度。水解反应前铬革屑质量记为mj，水分质量记为m2，灰分質量记为m3。水解反应结束后，过滤，将水解液烘干，称重，即胶原蛋白的质量记为m4（灰分含量很少，可以忽略不计），按下面公式计算提取率。

提取率=■×100%

3 毛细管电泳技术测定胶原蛋白样品的分子量

3.1 新毛细管的处理方法

为降低新制成的毛细管内壁表面硅羟基解离对电渗产生的影响，在正式实验前要对毛细管进行老化处理，具体过程如下：

先用重蒸水冲洗20min后用0.1mol/L的HCl溶液冲洗30min；再用重蒸水冲洗冲洗5min后，用0.1mol/L的NaOH溶液冲洗30min；最后用电泳缓冲液冲洗20min。

3.2 实验过程中毛细管处理方法

在实验过程中毛细管柱要经常冲洗，每进样一次，需冲洗一遍毛细管，具体程序如下：

每天在使用前，先用重蒸水冲洗10min后，用0.1mol/L的HCl溶液冲洗10min先用0.1mol/L的NaOH冲洗10min，最后用缓冲液冲洗10min。

在实验过程中，每进样一次后，要用0.1mol/L的HCI溶液冲洗1min，0.1mol/L的NaOH冲洗1min，最后用缓冲液冲洗1min后才可进样。

当出现基线非常不稳定或者蛋白质吸附情况严重时，可对毛细管再次进行老化处理。

3.3 实验结束后毛细管处理方法

首先用0.1mol/L的HCl冲洗10min，用重蒸水冲洗5min；再用0.1mol/L的NaOH冲洗10min，重蒸水冲洗5min后将其两端浸泡于重蒸水中。

4 结束语

毛细管电泳实验后得出碱-酶法从铬革屑中提取的胶原蛋白的平均分子量集中在2300～3300Da之间。酸法水解提取胶原蛋白的研究结果表明，提取条件为硫酸用量0.3ml（草酸用量8%），反应温度80°C，反应时间2h，此时胶原蛋白的提取率为80%左右，在毛细管电泳条件相同的情况下，硫酸和草酸水解提取胶原蛋白的分子量分布大体一致；草酸提取的胶原蛋白可控制其分子量在20kD左右，而硫酸提取的胶原蛋白可控制其分子量在15KDa左右。由以上数据可以得出，酸法提取的胶原蛋白可以控制其分子量分布比较集中，分子量的最大含量已经达到60%以上。

参考文献

[1]水解胶原蛋白分子量控制技术的研究[D].天津科技大学，2014.

[2]黄惠君.水解胶原分子量测定方法的探讨[J].明胶科学与技术，2010，30（1）：35-42.

[3]张素风，王群，王学川，etal.水解胶原蛋白乳化性和乳化稳定性研究[J].陕西科技大学学报，2014（4）：10-13.

[4]张慧洁，丁志文，庞晓燕，etal.水解胶原蛋白及其表征的研究进展[J].皮革与化工，2013，30（1）：17-21.