不同氮肥水平下春季茶树新梢代谢组学变化

刘健伟，方寒寒，马立峰，袁新跃，倪小明

(1.杭州市富阳区农业技术推广中心，浙江 杭州 311400； 2.中国农业科学院茶叶研究所 农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008； 3.富阳学院，浙江 杭州 311400； 4.杭州市富阳区食品安全检验检测中心，浙江 杭州 311400)

茶树主要以新梢采摘，一年有多次采摘和修剪，需要消耗大量营养物质。氮素在茶树新梢中的含量高达60～70 g·kg-1，1 hm2成龄茶园每年需要300～450 kg的氮肥才可满足茶树生长的需要。不同氮肥投入水平会显著影响茶树的产量及品质[1]。Ruan等[2]研究发现，不同氮素水平下，茶树碳氮分配比例存在差异，并且氮素显著影响茶树体内的代谢循环，与低氮相比，适氮条件下茶氨酸含量显著增加，茶多酚含量明显降低，茶叶品质得到显著改善。

茶叶的品质代谢物随季节转换发生显著变化，甚至在同一季节的不同时期，绿茶的品质代谢物也会发生深刻的变化，这可能与新梢的生长速率、气候条件、营养的供应等很多因素有关[3-4]。茶叶品质代谢物的变化除了受气候条件影响外，还会受到营养器官贮藏的C、N再活化及转运等因素的影响[5]。Liu等[5]通过评估春季早、中、晚3个时期茶叶初级和次级代谢产物的动态变化，发现春茶后期新梢氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等氨基酸类物质的含量显著降低，而黄烷醇、槲皮素及其糖苷含量显著升高。

代谢组学是系统生物学的一种研究方法，近年来在茶叶方面应用广泛，主要用于茶叶品质鉴定。Lee等[6]利用代谢组学的方法分析了地理位置与气候变化对绿茶代谢物的影响，阐明了气候与代谢产物变化的关系。Pongsuwan等[7]利用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)综合评估了日本绿茶，创建了品质安全模型，发现了众多与品质有关的生物标志物。景进等[8]收集了我国7个产区50个品种的绿茶样品，通过代谢组学方法得到绿茶代谢指纹图谱，初步实现了绿茶品质等级划分。Lee等[9]利用代谢组学的方法分析了绿茶的营养和感观品质，总结出了遮光下绿茶的代谢途径，阐述了遮光与品质的关系。Zhang等[10]利用代谢组学的方法揭示了光敏感性茶树品种黄金芽在不同光源下黄酮类代谢物的调控机理。本文利用代谢组学技术研究了春季不同氮肥水平下茶树新梢在不同采摘时期的代谢物变化，旨在为茶树的高产优质栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验设在中国农业科学院茶叶研究所塑料大棚内进行，茶树品种为龙井43，于本试验开始1 a前栽植于营养钵(35 cm×35 cm)中，适时浇水养护，每盆装土10 kg，定植6株龙井茶苗。

1.2 方法

试验设3个氮肥用量处理，于2017年2月1日在茶树根系附近施用：N1，低氮水平，每盆施0.2 g尿素；N2，适氮水平，每盆施2.2 g尿素；N3，高氮水平，每盆施4.8 g尿素。分别于3月25日(T1)、4月1日(T2)、4月6日(T3)进行采样，采摘标准为一芽二叶。采摘的新梢样品迅速称重，液氮中冷却，然后置于超低温冰箱(-70 ℃)保存备用。

1.3 基于UPLC-Q-TOF/MS代谢组学的分析

新梢样品中代谢物提取采用75%甲醇和25%甲酸(FA)混合试剂[11]。提取后的上清液注入UPLC-Q-TOF/MS(Waters，UPLC/Xevo G2-S Q-TOF)，用HSS-T3柱进行分离。首先，每2 h进行1次滤液注射，对该方法的稳定性进行重复测试。稳定后，取样品进行代谢组学分析。UPLC-Q-TOF/MS正负离子模式下采集数据集，数据集处理采用TransOmics软件进行，参考文献[11-12]中的保留时间和质量数鉴定代谢物。参照Liu等[5]分类确定代谢成分。

1.4 数据处理与分析

UPLC-Q-TOF/MS的预处理数据集输出到SIMCA-P13.0软件(Umetrics, MKS Instruments Inc., Sweden)进行多变量数据分析。对数据进行Pareto Scaling和可视化，绘制主成分评分，其中每个坐标代表一个单独的茶叶样品。

使用SIMCA-P(version 13.0, Umetrics,Umea, Sweden)软件进行多元统计分析，对于分类和处理进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。PCA从宏观上区分出不同组间代谢物变化的差异程度，OPLS-DA分析不同处理间引起代谢物差异的信息。OPLS-DA模型可获得代谢物差异数据的VIP值，并作为代谢物选择的系数，用t检验(P<0.05)对代谢物差异的显著性进行验证，最后获得对不同组间差异有重要贡献的代谢产物。

2 结果与分析

2.1 氮素水平对不同时期茶树新梢产量及百芽重的影响

如表1所示，在T1时期，随着氮素的增加，每盆新梢产量显著增加，百芽重也相应增加，且N3和N1处理的差异达显著水平；在T2时期，每盆新梢处理以N2处理的最高，显著高于其他处理，每盆百芽重在不同处理间无显著差异；在T3时期，3个氮素水平下茶树新梢产量、百芽重均无显著变化。

表1 不同施氮水平不同时期茶树新梢每盆新梢产量及百芽重

注：同列数据后无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。

2.2 新梢代谢组学分析

通过UPLC-Q-TOF/MS在茶叶新梢中共鉴定出1 710种代谢产物，以TransOmics软件获取的数据集为依据进行主成分分析(图1)。新梢的代谢产物在3个时期能明显分离。在T1时期，N1、N2、N3处理下的茶树新梢样品明显区分；在T2时期，N2处理的样品能与N1和N3处理的样品相区分；在T3时期，3个处理的样品区分不明显。与不同氮肥处理相比，不同时期对新梢代谢物的影响更大。

2.3 新梢差异代谢物的变化

通过多次筛选VIP>1、P<0.05的差异代谢物，最终选定部分差异代谢物进行统计分析(表2)。

图1 不同氮素水平下春季茶树新梢不同时期代谢物的主成分分析结果

表2 差异代谢物在不同处理不同时期的含量变化

注：鉴定级别Ⅰ的化合物使用质谱信息、保留时间以及标准品鉴定，鉴定级别Ⅱ的化合物运用色谱质谱信息和保留时间鉴定。公式中N1、N2、N3分别代表N1、N2、N3处理下的含量，T1、T2、T3分别代表T1、T2、T3时期的含量。

在T1阶段，与N1相比，N3条件下茶氨酸含量上升，没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯含量下降，而表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷、山柰酚含量增加。

在T2阶段，与N1相比，N3条件下，茶氨酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷、山柰酚含量增加，儿茶素、表儿茶素没食子酸酯含量下降。

在T3阶段，与N1相比，N3条件下，茶氨酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷含量增加。

与T1阶段相比，在T3阶段，茶氨酸显著下降，儿茶素类代谢物，如没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯含量显著上升。

3 讨论

氮素是茶树生长所必需的大量元素，不同氮肥水平、不同施用时间，甚至不同的施肥模式都会影响茶叶的产量和品质[12-15]。春季合理的氮肥施用可以提早茶芽萌发，增加新梢发芽轮次以及嫩度，提高发芽密度，同时合理的氮肥施用可以促进茶树体内光合产物和含氮化合物积累，增加氨基酸的含量，降低酚类化合物的含量，降低茶叶中酚氨比，从而有效地增加茶叶产量，提高茶叶品质[2,16]。春季不同时期采摘的茶树新梢，其代谢物也有显著差异[16]。本试验通过代谢组学研究了不同氮素供应下不同阶段茶树新梢品质代谢物的动态变化，进一步验证了先前的部分结果。同时，本研究发现，春季追施氮肥，氮肥施用不足和氮肥施用过量都会影响茶树的产量和品质，其影响在T1时期最为明显，增加氮素投入可以显著提高春季前期茶树采摘的新梢产量和百芽重。在品质代谢物方面，在T1时期，与N1相比，N3处理下儿茶素类物质(儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素)减少，氨基酸含量增加；此外，N2条件下，槲皮素鼠李糖苷，山柰酚葡萄糖苷含量与N1相比明显降低。这些都说明，追施氮肥改善了茶叶品质代谢成分。T2时期，适量的氮素显著增加了茶树的产量，但是过量的氮肥并没有显著提高茶叶的产量。品质代谢成分方面，N2、N3与N1相比，茶氨酸增加，儿茶素与表儿茶素没食子酸酯降低，但是代谢物无显著区分，总体上不同处理间代谢成分差异不大。T3时期，追施的氮肥并没有显著提高茶树产量，与N1处理相比，N3处理的表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷含量增加，代谢组学宏观上无显著区分。

总体上看，春季追施氮肥主要影响采摘前期(T1)的茶树，对中后期(T2和T3)影响不大。同时，与阶段采摘对新梢品质代谢物的影响相比，春季追施氮肥对新梢品质代谢物的影响较小。有研究利用15N追踪技术发现，大多数氮素在冬天被茶树吸收，其中很大一部分储存在根、茎、成熟叶中，当来年新梢萌发时，75%储存的氮将在新梢萌发时被重新利用，新梢中氮素约30%来源于新吸收积累，其余70%来自于根、茎、叶等器官的转运[16-17]。此外，春季追施的氮肥满足了前期茶树新梢萌发的需要，后期新梢萌发从土壤中吸收利用氮素较少，而从营养器官利用的活化养分较多[17]，所以春季追施的氮肥并未显著影响后期茶树新梢的产量与品质代谢物。

本试验明确了早春追肥氮素对茶树不同阶段生长的影响。为兼顾茶叶产量和品质，应防止过量施肥，适当提高追肥次数，以提高氮素利用效率，改善后期茶树新梢品质代谢物。同时建议重视秋季基肥的施用，加强贮藏器官氮素的积累，这也是春茶产量品质调节的重要手段。