宠物源大肠杆菌产ESBLs流行性调查与耐药机制研究

杨守深，王佳慧，林 敏，曾晓菲，邱敏华，陈文燕，何玉琴，林钊盛，林炜明

第三代头孢菌素具有高效、广谱、安全等优点是兽医临床重要的抗感染药物。随着第三代头孢菌素的广泛使用，大肠杆菌对此类药物的耐药情况日益严重。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是介导大肠杆菌对第三代头孢菌素耐药的重要机制。由于宠物与人类存在密切接触，两者之间的耐药菌可能互相传播，导致严重的公共卫生问题[1]。近年来广大的科研工作者对细菌耐药性及传播机制做了大量的研究，主要集中在食源大肠杆菌，对宠物源大肠杆菌的耐药性研究相对较少，其中很少有关宠物源产 ESBLs 大肠杆菌的分子流行病学的数据。

本研究对2014年从广州市动物医院采集患病犬猫的肛门拭子，分离大肠杆菌，通过测定宠物源大肠杆菌药物敏感性、ESBLs的流行分布特征、种族系统进化关系、耐药质粒CTX-M水平传播性及其基因环境等，为正确评估第三代头孢菌素在宠物临床中使用风险性及耐药基因的传播扩散。

1 材料与方法

1.1试剂 麦康凯琼脂、 LB 肉汤、LB 琼脂、MH 琼脂及MH肉汤，均购自广东环凯微生物科技有限公司。rTaq 酶、ExTaq 酶以及DNA 分子量标准购自 TaKaRa 公司。氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、喹乙醇、氯霉素、氟苯尼考、多西环素、黏菌素、磺胺甲噁唑以及甲氧苄啶购自中国兽医药品监察所。头孢他啶、头孢西丁和阿米卡星购自中国药品生物制品检定所。萘啶酸购自浙江国邦药业有限公司。引物合成和PCR产物序列测定由深圳华大基因股份有限公司完成。

1.2菌株的分离与鉴定 受试菌株为2014年从广州市4所动物医院采集犬猫肛门拭子样品共92份，其中猫源28份，犬源64份。将采集的拭子接种于LB肉汤培养基，震荡培养12～16 h后，均匀划线麦康凯琼脂培养基，过夜培养挑选具有大肠杆菌典型形态的单菌落，再次划线麦康凯琼脂培养基进一步纯化，最后通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)对疑似大肠杆菌菌株进行菌种鉴定。经分离纯培养后的大肠杆菌，用终浓度为30%灭菌甘油肉汤保存。

1.3药物敏感性测定 根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI，M100-S25)推荐的方法，采用二倍琼脂稀释法测定17种临床常见的抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，以完全抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。根据CLSI规定耐药折点分析受试大肠杆菌的耐药性情况，其中头孢噻呋[2]和氟苯尼考[3]的耐药折点参考文献报道，恩诺沙星的耐药折点参考(CLSI，M3-A3)鸡大肠杆菌的耐药折点。根据MIC的测定值，计算每种药物的MIC50和MIC90。其中大肠杆菌ATCC 25922为质控菌。

1.4种族进化关系分析 采用水煮法提取细菌基因组DNA。根据Clermont等文献报道[4]，采用PCR方法，以chuA基因、yjaA基因及一个未知 DNA片段TspE4.C2的存在或缺失，对所有大肠杆菌的种族系统进化关系进行分析。

1.5ESBLs耐药基因的筛选 采用水煮法提取耐头孢噻肟大肠杆菌(MIC≥4 μg/mL)的DNA，通过PCR对耐药菌检测了编码超广谱β-内酰胺酶的耐药基因CTX-M-1G、CTX-M-9G、TEM、OXA以及SHV，其引物序列参考相关文献报道，见表1。挑取阳性PCR产物送往深圳华大基因股份有限公司进行测序，将测序结果进行NCBI序列比对分析。

表1 基因引物序列及片段长度
Tab.1 Primer sequences of genes and gene length

基因类别基因名称 引物序列(5′-3′)片段长度/bp超广谱β-内酰胺酶TEMF: ATAAAATTCTTGAAGACGAAA1080[5]R: GACAGTTACCAATGCTTAATCSHVF: CACTCAAGGATGTATTGTG885[6]R: TTAGCGTTGCCAGTGCTCGOXAF:TGAAGGGTTGGGCGATTT925[7]R: ACCCGGAGCCTCATTAATTGTCTX-M-1GF: CTTCCAGAATAAGGAATCCC949[8]R: CGTCTAAGGCGATAAACAAACTX-M-9GF: GTGACAAAGAGAGTGCAACGG857[6]R: ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC种系发育chuAF: GACGAACCAACGGTCAGGAT279[4]R: TGCCGCCAGTACCAAAGACAyjaAF: TGAAGTGTCAGGAGACGCTG211[4]R: ATGGAGAATGCGTTCCTCAACTspE4C2F: GAGTAATGTCGGGGCATTCA152[4]R: CGCGCCAACAAAGTATTACG

注：F，上游引物；R，下游引物

1.6接合转移实验 为了研究CTX-M基因的水平传播情况，对携带CTX-M基因的阳性大肠杆菌进行接合转移试验。受体菌为E.coliC600(耐受链霉素 ≥2 000 μg/mL)。在含头孢噻肟(2 μg/mL)和链霉素(1 000 μg/mL)的双药板中筛选携带CTX-M基因的疑似接合子，并对接合子进行鉴定。接合子的药物敏感性测定同原菌MIC测定方法一样。对接合子中携带的质粒进行复制子类型检测，方法参考文献报道[9-10]。

2 结 果

2.1菌株分离鉴定 大肠杆菌在麦康凯培养基上为圆形凸起、边缘整齐深红色的菌落；在伊红美蓝培养基上是中心为黑色、有金属光泽的菌落。在革兰氏染色以及油镜下观察，大肠杆菌为红色短杆菌。从92份样品中挑选在麦康凯琼脂培养基上形态符合的单菌落(犬样品数为64份，猫的样品数为28分)，共获得疑似大肠杆菌71株，进一步通过MALDI-TOF MS质谱仪鉴定，确定56株为大肠杆菌，其中43株为犬源，13株为猫源。大肠杆菌总的分离率为60.9%(56/92)，其中犬源和猫源样品的分离率分别为67.2%(43/64)和46.4%(13/28)。

2.2药物敏感性测定 分离株对测试药物表现出较强的耐药性，结果见图1和表2。11种抗菌药物的耐药率均达到50%以上。对氨苄西林耐药率最高，达到100%；其次是磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和萘啶酸，耐药率分为89.3%和87.5%；黏菌素耐药率最低为7.1%。对头孢菌素类抗菌药物耐药程度不一，对第三代头孢菌素头孢噻呋和头孢噻肟较高， 耐药率分别为57.1%和55.4%，而对头霉素类头孢西丁和第三代头孢菌素头孢他啶耐药率较低，分别为16.1%和10.7%。另外，头孢噻呋和头孢噻肟的MIC90也较高为256 μg/mL，MIC50分别为16 μg/mL和4 μg/mL，而头孢他啶的MIC90和MIC50都较低，分别为8 μg/mL和0.125 μg/mL。对3种或者6种以上抗菌药物耐药的菌株数分别为55株和47株，分别占分离株的98.2%(55/56)和83.9%(47/56)，多重耐药较为严重。31株对头孢噻肟耐药(MIC ≥ 4 μg/mL)，均为多重耐药，且都是对7种及7种以上抗菌药物耐药。

注：CTX，头孢噻肟；CAZ，头孢他啶；CIF，头孢噻呋；FOX，头孢西丁；AMP，氨苄西林；STR，链霉素；GEN，庆大霉素；AMK，阿米卡星；NAL，萘啶酸；CIP，环丙沙星；NRO，诺氟沙星；OLA，喹乙醇；CHL，氯霉素；FFC，氟苯尼考；DOX，多西环素；CS，黏菌素E；S/T，磺胺甲噁唑/甲氧苄啶图1 宠物源大肠杆菌对药物的耐药率Fig.1 Resistance rates of pet-originated Escherichia coli for antimicrobials

表2 宠物源大肠杆菌MIC50和MIC90的分布情况
Tab.2 Distribution of the MIC50and MIC90among pet-originatedEscherichiacoli

抗菌药物CTXCAZCIFFOXAMPSTRGENAMKNALCIPNROOLACHLFFCDOXCSS/TMIC50(μg/mL)40.125168>2562566442568128161616160.5>320MIC90(μg/mL)256825632>256>256>256>256>256128256256256256642>320

2.3种族进化关系分析 对分离的56株宠物源大肠杆菌的种族进化系统关系进行分析，结果显示主要分布在A组(25/56，44.6%)，其次是B1组，(21/56，37.5%)，B2组(8/56，14.3%)和D组(2/56，3.6%)分布最少。

2.4ESBLs 耐药基因的筛选结果 在56 株大肠杆菌中有31株耐头孢噻肟，其中13株检测到携带CTX-M，检出率为23.2% (13/56)，其中CTX-M-9G和CTX-M-1G分别为8株和5株。本实验中共检测到5种不同的亚型，CTX-M-9G中共检出2种亚型分别是CTX-M-14和CTX-M-65，检出率均为12.9%(4/31)；CTX-M-1G中最为流行的亚型为CTX-M-55，检出率为9.7%(3/31)，其次是CTX-M-3和CTX-M-64，检出率均为3.2%(1/31)。TEM、OXA和SHV型基因未检出。种族系统进化关系分析显示，13株携带CTX-M的菌株主要分布在B1组(5)，其次是A(4)和B2组(4)，相关实验结果见表3。

2.5接合试验结果 对13株携带CTX-M基因的菌株进行接合转移试验，有7株CTX-M基因成功转移，另外6株菌中，经过多次尝试，都未获得携带阳性接合子。药物敏感性测定结果显示，7株接合子对头孢噻呋、头孢噻肟以及头孢他啶的MIC较受体菌提高了4～32倍。另外，接合子对链霉素、庆大霉素、阿米卡星、多西环素的MIC值均有不同程度的升高。复制子分型结果显示，7株接合子都携带IncFIB型质粒。

表3 携带CTX-M基因大肠杆菌耐药谱、种系发育背景及亚型流行分布特征
Tab.3 Resistance spectrum, phylogenetic background and distribution characteristics of subtype in CTX-M gene ofEscherichiacolicarrying

序号来源耐药谱种系发育关系亚型1猫CTX、CIF、AMP、STR、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、DOX、S/TACTX-M-32狗CTX、CIF、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/TB1CTX-M-553猫CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、S/TB2CTX-M-554猫CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、S/TB2CTX-M-555狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、CHL、FFC、DOX、S/TACTX-M-646狗CTX、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、DOX、S/TB1CTX-M-147猫CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、CIP、NRO、FFC、DOX、S/TB2CTX-M-148猫CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、CIP、NRO、OLA、FFC、DOX、S/T、CSB2CTX-M-149狗CTX、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、CHL、DOX、S/TB1CTX-M-1410狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/TACTX-M-6511狗CTX、CAZ、CIF、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/T、CSACTX-M-6512狗CTX、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、DOX、S/TB1CTX-M-6513狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、S/TB1CTX-M-65

3 讨 论

本研究调查了广州市动物医院宠物源大肠杆菌耐药情况，结果显示广州地区宠物源大肠杆菌耐药情况较为严重，其中氨苄西林、链霉素、多西环素、萘啶酸以及复方新诺明等耐药率达到70%以上；第三代头孢菌素头孢噻肟和头孢噻呋以及氟喹诺酮类药物环丙沙星和诺氟沙星也呈现较高的耐药率，均超过55%；对酰胺醇类药物氯霉素和氟苯尼考耐药率在50%左右。但是在受试的17种抗菌药物中，对阿米卡星耐药率相对较低为33.9%，对头孢他啶和头孢西丁的耐药率不超过20%，对黏菌素的耐药率最低，仅为7.1%。另外，多重耐药情况也较为严重，对3种或者6种以上抗菌药物耐药的菌株分别占98.2%和83.9%。本次药敏试验结果与吉林地区宠物源大肠杆菌相比，头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星等重要的抗菌药物耐药率相接近，但是本研究头孢他啶(10.7%)和阿米卡星(33.9%)的耐药率明显低于吉林地区(35.8%，77.6%)，两地的黏菌素的耐药率均处于较低水平，耐药率分别是7.1%和3.9%[11]，但是扬州地区黏菌素的耐药率却高达23.5%[12]。邹梦婷[13]和陈孝杰[14]也测定广州地区宠物源大肠杆菌耐药性情况，其中邹梦婷测定菌株是耐庆大霉素和阿米卡星的肠杆菌，本研究中头孢噻肟、氨苄西林和氟苯尼考的耐药率(55.4%、100%、51.8%)与邹梦婷(55.8%、97.4%、53.3%)相似，其耐药性都明显高于陈孝杰的研究结果(25%、80%、27%)。以上的研究结果表明我国宠物源大肠杆菌耐药情况较为严重，对临床上治疗革兰氏阴性菌感染的一线药物，第三代头孢菌素和氟喹诺酮类药物耐药率较高。宠物源大肠杆菌严重耐药性问题，可能与国内宠物行业的发展过程中，抗菌药的大量、不规范使用密切相关。宠物源大肠杆菌对黏菌素以及头孢西丁耐药率较低，可考虑在治疗宠物源多重耐药的大肠杆菌感染性疾病时，可使用这两种抗菌药物，但仍需测定菌株的耐药谱，严格控制使用剂量和频率，减少耐药性的产生。

第三代头孢菌素是临床上治疗革兰氏阴性菌感染的一线抗菌药物，而ESBLs是介导对第三代头孢菌素耐药的主要机制。目前，ESBLs以TEM、SHV、CTX-M和OXA型较为常见，其中，质粒介导的CTX-M 型ESBLs流行性最广，同时可分为 5个亚群：CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G 和CTX-M-25G[15]。本研究在31株耐头孢噻肟的菌株中只检测到CTX-M型ESBLs，检出率为41.9% (13/31)，其亚型以CTX-M-14， CTX-M-65和CTX-M-55为主；未检测到TEM以及SHV型ESBLs基因，说明还可能存在其他机制降低对三代头孢菌素的敏感性。2003-2012年从我国患病食品动物源中分离的大肠杆菌中，CTX-M检测率为20.1%，其中，最为流行的CTX-M亚型为CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-65[16]。 这表明本研究中CTX-M的流行率高于我国患病食品动物源大肠杆菌中CTX-M的流行率；另外，大肠杆菌中主要流行的CTX-M亚型在我国宠物源中与患病食品动物源中较为一致。在韩国流浪狗和宠物医院狗肠道样品大肠杆菌对头孢噻肟的耐药率仅为2.9%，其中CTX-M的流行率为1.9%[17]；在美国宠物狗和猫粪便样品中，只有3%的大肠杆菌分离株产ESBLs，其中CTX-M均属于CTX-M-1G，主要亚型包括CTX-M-15、CTX-M-14和CTX-M-24；同时还检测到TEM，SHV 以及OXA-10等编码ESBLs的基因[18]，而在本研究中仅检出CTX-M，其他的耐药基因均未检出。在欧洲，患病宠物源的肠杆菌中，3.6%的分离株对头孢噻肟(EUCAST)耐药，但产ESBLs菌株仅为1.6%，主要产CTX-M酶为主，极少数产TEM酶[19]。这表明我国宠物源大肠杆菌对三代头孢菌素耐药率以及CTX-M流行率都远高于国外，这个可能与我国第三代头孢菌素广泛用于人医临床以及兽用抗菌药物头孢噻呋等广泛用于动物密有关。另外，我国宠物源大肠杆菌编码ESBLs的基因主要为CTX-M，很少见TEM，SHV 以及OXA等ESBLs，并且国内外流行的CTX-M亚型也有差异。 这表明我国宠物源大肠杆菌ESBLs基因的流行特征和国外存在一定的差异。

本次分离的大肠杆菌主要分布在A和B1群，即为共生型大肠杆菌。只有少部分的分离株(10/56，17.9%)为B2和D群，与毒力相关；其中4株携带CTX-M的大肠杆菌来源于B2群。人医临床上介导CTX-M-15基因广泛传播的国际流行株ST131大肠杆菌也属于B2群[20]；在伴侣动物源大肠杆菌中也检测到携带CTX-M-15散播B2-ST131型克隆株[21]。宠物源具有致病性，并携带有CTX-M耐药基因大肠杆菌极有可能通过亲密接触传给人类，因此，应引起足够的重视。

对13株携带CTX-M菌株进行接合转移试验，只有7株菌中CTX-M成功转移，并获得7株接合子。比较供体菌、受体菌以及接合子的MIC值发现，接合子对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢他啶的MIC值与供体菌相同或相近，较受体菌明显升高，说明通过质粒在供体菌和受体菌之间发生接合转移；对氨基糖苷类药物中的链霉素、庆大霉素、阿米卡星以及四环素类药物中的多西环素的MIC值均有不同程度的升高，说明介导细菌对于其他药物耐药性的基因也随着质粒的转移而发生传递。7株CTX-M ESBLs接合子中，质粒类型均为IncFIB，属于IncF群。近年来，许多研究发现复制子类型为IncFIB的质粒经常在大肠杆菌中发现并且非常容易在大肠杆菌之间发生接合转移，并且CTX-M基因通常位于可接合性IncF质粒上[22]。虽然本研究获得接合子的复制子类型均为IncFIB，但其耐药谱不同，表明同一复制子型的质粒可携带不同的基因型。因此应重视对CTX-M酶细菌感染的治疗和预防，对防止其他耐药基因在大肠杆菌中的广泛传播扩散具有重要意义。

利益冲突：无