肩袖损伤患者的夜间疼痛与生物钟的联系

赖圳登综述，包倪荣，赵建宁审校

0 引 言

生物钟是指生命体内多种具有内在节律的基因调控相应的蛋白表达，影响细胞、组织、系统、器官的活性与功能，使得在不同时间段活性与功能有所不同。Hall、Rosbash以及Young三位科学家首先在果蝇的体内分离出“时间基因”（Period gene）［1-2］。且Jeffrey和Rosbash发现了时间基因可转录、翻译成“时间蛋白”（period protein，PER）。此蛋白是果蝇体内一种具有在夜间累积、在白昼分解的具有明显周期性的摆动蛋白，且周期为24 h。Young发现了第二种时间基因“Timeless 基因”（TIM）［3］，可转录、翻译成TIM蛋白。Young在实验中发现，TIM蛋白会结合到PER蛋白上，一起进入细胞核，共同起到抑制PER基因的活性作用。进一步研究后，Young又发现一个生物节律基因，称为“延时基因”（Doubletime gene）［4］，这个基因编码的 DBT 蛋白又可延迟PER蛋白的积累，让PER蛋白增加和减少的周期固定在24小时左右。至此，果蝇生物钟的分子运作机制基本明确。日裔科学家高桥用小鼠做实验，发现了哺乳动物的生物时钟基因——Clock基因和其编码产生的CKIε蛋白（激酶）［5］，才比较完整地解释了人和哺乳动物的生物钟，也比较清楚地说明该生物时钟是由Clock基因及CKIε蛋白、PER基因及其蛋白、TIM基因及其蛋白、DBT基因及其蛋白这4种基因和蛋白共同作用，形成了哺乳动物和人的24小时生物昼夜节律，且周期震荡性由视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）控制。肩袖损伤被认为是人类肌肉组织自然衰退的表现，肩袖撕裂的危险因素包括创伤史，优势臂和年龄［6］。随着年龄增长尤其在50岁之后，肩袖损伤极其常见。30%～70%的肩关节疼痛均与肩袖损伤有关，其发病率占肩关节损伤的5%～40%［7］。有多种因素可引起肩袖损伤，结合早期研究与近期研究，内在因素主要有灌注减弱、退行性改变、退行性轻微损伤、内分泌因素、代谢因素、细胞凋亡、TGs表达减弱、MMPs失调等；外在因素主要有慢性炎性浸润、轻微损伤、急性损伤、多因素损伤［7］。其中，Neer等［8］在1972年提出肩峰撞击学说，并认为95%的肩袖损伤是肩峰下撞击所致。Neer等［9］提出肩关节撞击征发展过程分为可逆阶段、不可逆阶段和肌腱断裂，这是一种慢性炎症浸润的过程。这一观点受到广泛认同，近期有研究人员在大鼠肩峰处植入以PEEK为材料的3D打印植入物后驱赶大鼠跑台，每天跑台一次，一次30 min，持续2～8周以模拟肩峰撞击征，分别在第二周、第四周、第六周、第八周处死大鼠并得到的病理结果成阶段性炎性发展而且最终发展为肌腱全层撕裂［10］。肩袖损伤患者的颈肩部疼痛以夜间疼痛加剧白昼疼痛缓解为特殊临床表现，且91%年龄超过65岁的肩袖损伤患者都有夜间疼痛［11］。患者夜间出现明显的剧烈肩部疼痛，位置常在肩峰下方。反复不规则的颈肩部疼痛使得患者十分痛苦，无法患侧卧位，大部分不能或不敢做伸肘屈肩抬臂等动作，严重影响睡眠。

1 肩袖损伤夜间疼痛的形成机制

1.1 神经源性炎症反应夜间活跃神经源性炎症是由小直径感觉神经元C-5纤维受到伤害性刺激后释放神经肽于外周组织并作用于内皮细胞、肥大细胞、免疫细胞及血管平滑肌等，继而引起外周组织血管扩张、局部充血、血流量增加且血管通透性增强、血浆蛋白渗出，引起组织水肿，表现为局部红、肿、热及痛觉过敏［12］。现研究认为肩峰下滑囊炎症反应是肩袖损伤产生疼痛的主要原因，且疼痛的程度与肩峰下滑囊炎症程度呈正相关［13］。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素1（Interleukin1，IL-1）、IL-1β、IL-6、基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP-1）、MMP-9、环氧化酶1（Cyclooxygenase1，COX-1）、COX-2、P物质等在肩袖损伤患者的滑囊组织中高表达。上述高表达物质中，P物质是最早发现的神经肽，参与神经源性炎症反应，而其中COX-2已被证实是调节外周ephrinBs/EphBs信号激活引起的痛觉所必须的［14］，其余因子与NF-kB激活的炎症反应相关。另有研究通过多普勒超声检查发现，肩袖损伤患者的旋肱前动脉血流量夜间较白昼明显增多［15］，也进一步证明肩袖损伤患者肩峰下滑囊内由NF-kB激活的炎症反应以及COX-1等物质起到的扩张血管，增加血流量的作用是具有昼夜节律性的。

1.2 继发性外周及中枢敏化肩袖损伤的袖口撕裂多为创伤性与退行性，创伤性撕裂是由于明显的创伤，而退行性疾病则更加常见［16］。由于外在因素和内在因素的影响，导致鞘肌腱逐渐衰竭，伴有或不伴有叠加的急性损伤，最终会导致全层撕裂，并损伤周围细胞。损伤细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞将释放神经递质，如P物质、降钙素相关肽等进一步导致外周传入纤维痛阈值下降，使得外周细胞对痛觉敏感化。长期组织水肿如未及时改善将继发性地诱发中枢敏化［17］，即肩袖损伤患者在外周伤害信息的持续输入条件下，将调控脊髓背角中的痛觉传递神经元，使其突触的兴奋性增加、发放阈下降，产生痛觉过敏、痛觉超敏以及痛觉感知范围增大，使得疼痛加剧［18］。此种神经源性炎症反应造成的继发性外周及中枢敏化在夜间表现更为明显。

1.3 褪黑激素起到重要作用最新研究表明，肩部夜间痛与人体大脑分泌的一种叫褪黑素的物质有关［19］，褪黑激素的分泌具有明显周期性:白天分泌少、晚上分泌多。夜间和清晨的褪黑激素水平峰值可能会激活炎症反应，并可能导致夜间疼痛程度增加［20-21］。肩袖撕裂损伤时，周围组织褪黑素受体明显增加，更多的褪黑素与周围的褪黑素受体结合，可使局部炎症介质释放增加。而目前研究认为褪黑激素受体在痛觉信息的传输中起到重要作用［22-23］。褪黑激素可能在肩袖撕裂中起到夜间疼痛的介质的作用，这种作用可能是通过褪黑激素受体介导的。其具体机制需要更多的研究证实。

1.4 受到肩关节解剖学影响肩袖损伤患者夜间疼痛的表现与解剖学因素密切相关，长期慢性卡压造成的肩袖损伤，患者的肩关节滑囊常发生粘连、肌肉挛缩，尤其以肩峰下滑囊、三角肌下滑囊、肩胛下肌下滑囊最为明显，盂肱关节变得僵硬，继而使肩胛骨外展。患者入睡时，外展的肩胛骨受到挤压沿着胸壁向后、向内运动，使得原本僵硬的盂肱关节过度拉伸，其关节囊张力增加，关节囊上的自由神经末梢受到刺激出现疼痛。另外，患者入睡时，常自然出现侧卧位，患侧肩关节外展并内旋，位于冈上肌腱前缘和肩胛下肌腱上缘的肩袖间隙会与前方的喙突尖部发生撞击引发疼痛［24-25］。

2 生物钟在关节疾病中扮演重要角色

2.1 生物钟与类风湿性关节炎类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的症状经常显示昼夜变化，如关节僵硬和关节痛在早晨恶化。这是RA的症状随着RA介导细胞因子的循环浓度的每日振荡而变化的表现。特别是可受到免疫细胞调控的IL-6显示出强烈的分子振荡性，而血清IL-6水平的波动与疾病症状的变化相关。迄今为止，RA中驱动昼夜节律疾病表达的显性细胞类型仍未确定。可能成为节律性IL-6分泌基础的候选者之一是CD4+T淋巴细胞，研究显示CD4+T淋巴细胞具有昼夜节律振荡性，是通过改变细胞增殖和细胞因子分泌所体现的［26］。故其被认为是RA的关键介质，在疾病发生和持续中具有一定的作用。

此外，巨噬细胞具有内在时钟，超过8%的巨噬细胞转录组受到昼夜控制［27］。尽管认为巨噬细胞不参与RA的起始，但其促炎和组织破坏作用有助于疾病表达，且这些吞噬细胞在糜烂性疾病中介导炎症和组织破坏中的关节。最近的一项研究表明IL-6对人和小鼠巨噬细胞的刺激有节奏，并确定了时钟基因（和核受体）rev-erbα在产生这些节律中的重要性［28］。最后，位于滑膜内膜衬里内的类似滑膜细胞的成纤维细胞也有昼夜节律振荡。这些细胞是RA中促炎细胞因子的主要来源，尽管在活动性疾病中它们可能不再振荡。

总之，免疫系统的各个细胞成分启动并持续存在炎症通路是受到生物钟严格调节的。许多候选细胞可以协调IL-6分泌中的昼夜节律振荡性。然而，发挥这种时钟控制的机制尚未完全建立。

2.2 生物钟与膝关节骨关节炎昼夜节律功能障碍与许多疾病有关，其中包括关节软骨动态平衡和骨关节炎（osteoarthritis，OA）的病理生理学作用。最近一项研究用小鼠测试了昼夜稳态的环境或遗传破坏是否倾向于OA样病理变化［29］。该研究分别在光照（Light，L）:黑暗（Dark，D）循环和昼夜节律遗传破坏的条件下观察雄性小鼠的昼夜节律运动活动。将野生型（Wide type，WT）小鼠随机分两组，一组维持恒定的12小时L:12小时D循环，另一组暴露于每周12小时相移。另外，将雄性昼夜节律突变小鼠（ClockΔ19或Csnk1etau突变体）与年龄匹配的WT同窝小鼠进行比较，所述WT同窝小鼠维持在恒定的12小时L:12小时D循环。研究发现:昼夜节律的环境破坏通过抑制蛋白多糖积累，上调基质降解酶和下调小鼠膝关节中的合成代谢介质来促进骨关节炎的改变。

从机制上讲，这些作用涉及PKCδ-ERK-RUNX2/NFκB和β-catenin信号通路的激活，包括基质金属蛋白酶13（MMP-13）和聚蛋白多糖酶5（ADAMTS-5）的刺激，以及相关软骨细胞中合成代谢介质SOX9和TIMP-3的抑制。时相移位的小鼠其昼夜节律稳态的遗传破坏不易导致关节中OA样病变。该研究结果首次提供了令人信服的体内证据，即昼夜节律的环境破坏是小鼠膝关节OA样病变的发生的危险因素。

2.3 生物钟与肩周炎与肩袖损伤相似，虽然致病机理不同，但是肩周炎患者夜间疼痛显著，睡眠受到严重影响，长期的睡眠不足常导致患者易怒和抑郁［30］。有研究发现褪黑激素可能在肩周炎产生夜间痛的机制中发挥一定作用。褪黑激素是由脑松果体分泌的吲哚杂环类化合物，在调节生理周期、免疫、炎症介质的产生及疼痛调节方面发挥重要作用，其分泌具有明显的昼夜节律，夜间分泌量显著高于白天。

Ha等［19］通过对比肩袖损伤患者、肩周炎患者和正常人的肩峰下滑囊和关节囊组织发现，在肩袖损伤和肩周炎患者肩峰下滑囊和关节囊组织中，褪黑素受体1A（MTNR1A）、褪黑素受体1B（MTNR1B）及敏感离子通道3（ASIC3）的表达明显升高。同时，Ha等［19］还进行了体外成纤维样滑膜细胞原代培养，结果发现10nM浓度的褪黑素能够诱导成纤维样滑膜细胞表达ASIC3及炎症介质IL-6，通过褪黑素受体拮抗剂处理后能够逆转这一现象。他们还发现炎症介质IL-1β，TNF-α能够诱导MTNR1A及MTNR1B表达，褪黑素对炎症介质的释放具有重要的调节作用，褪黑素可能通过调节炎症介质的释放对MTNR1A及MTNR1B的表达产生重要影响。据上述实验结果，研究者认为夜间褪黑素分泌增加，通过作用于褪黑素受体及ASIC3对肩周炎和肩袖损伤患者产生夜间疼痛有重要作用。但是，这一猜想仍需要进一步验证。

3 结语与展望

临床中，反复夜间疼痛是肩袖损伤患者的常见就诊原因、主要临床表现同时也是术后常见症状之一。然而，产生这一症状的原因并不明确。目前的研究成果表明生物钟在代谢、机体炎症反应以及免疫反应中具有重要意义，且在许多关节疾病中扮演重要角色。近期，有研究指出狒狒体内，许多组织类型和大脑区域中有近80%的基因活动都遵循昼夜节律［31］，提示生物钟可影响对疾病机制的理解并提出优化的疗法。科学家自发现生物钟至今，对生物钟的研究不乏与骨科、运动医学相关，目前研究发现褪黑激素分泌增加可能与肩关节夜间疼痛加剧有关，其作用机制仍需要进一步证实。若想确定肩袖损伤患者表现出的夜间疼痛是否具有昼夜节律性，至少还需要证明以下几点:①已经找到肩袖损伤的炎症反应中某种或多种特殊的炎症因子，或肩袖损伤引起的免疫系统功能变化关键因子；②证明其参与肩袖损伤产生疼痛的途径及相关作用机制；③从基因层面证明这种特殊的炎症因子或免疫因子在肩袖损伤患者体内具有分子振荡性；④这种分子振荡周期与SCN具有同步的节律性。若经过实验证明，肩袖损伤的夜间疼痛特殊临床表现符合以上4点，则可说明其具有昼夜节律性。综上所述，肩袖损伤患者的夜间疼痛临床表现与人体生物钟存在一定联系，探讨其作用机制对临床诊断、治疗及新药研究有指导作用。