外周血循环肿瘤细胞及其趋化因子受体CCR9与非小细胞肺癌的临床相关性

林思阳，蒿艳蓉，吕艳茹，冯国生，林 辉，李柏钧，袁贤彬，曹宇华，侯恩存，陆 翔

0 引 言

在最新发布的《2018年全球癌症统计数据》中，肺癌仍然以11.6%的发病率与18.4%的病死率高居全球恶性肿瘤首位［1］。在中国，肺癌仍是发病率与病死率最高的恶性肿瘤［1］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测是备受关注的“液体活检”技术，并证实其在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤的诊断、治疗、预后中有积极的临床应用价值［2-6］。

CTCs是具有变形能力的异质性肿瘤细胞，可携带原发肿瘤特异性抗原与基因特征从原发肿瘤中脱落，侵袭进入循环系统。在迁移过程中，新基因突变（如休眠相关基因、凋亡抑制相关基因）使CTC获得逃避机体免疫监视与免疫清除的特性［7］；而上皮间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程不仅可增强CTCs的抗凋亡能力，EMT过程导致的CTCs表型改变还可进一步促进肿瘤从原发病灶的转移与侵袭［8-9］。此外，部分CTCs还具有干细胞特征，在克服了血流剪切力的机械破坏和逃避机体免疫监视后可迁徙转移至远处器官形成新病灶［10］。外周血循环肿瘤细胞是恶性肿瘤出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。

趋化因子受体9（chemokine receptor 9，CCR9）是一类具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体；趋化因子受体配体CCL25是其特异性配体。CCR9/CCL25参与调节体内免疫细胞分化、发育，白细胞定向迁移，调控免疫应答等多个生理过程，并与多种肿瘤的生长、转移及血管生成相关［11］。CCR9-CCL25轴可通过调节肺癌细胞基质金属酶（MMP2、MMP9）及其组织特异性抑制物（TIMP-1、TIMP-2）的表达水平促进肺癌细胞的侵袭与转移，与患者的预后相关［12］。本研究旨在探讨CTCs及CTCs中CCR9表达水平与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的临床相关性，探讨其在NSCLC筛查及肿瘤侵袭、转移风险预测中的潜在作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2018年5月至2019年6月就诊于广西壮族自治区人民医院临床肿瘤中心的NSCLC患者共62例。所有患者均经细胞学或组织病理学确诊，其中肺腺癌43例、肺鳞癌15例、其他病理类型NSCLC 4例；男31例、女31例，年龄36～79岁，平均（58.0±8.9）岁；I-ⅢA期16例、ⅢB-Ⅳ期46例；远处转移37例、无转移25例；肿瘤大小T1-T2期36例、T3-T4期26例。入组标准：①年龄≥18岁，性别不限；②PS评分0～2分；③血红蛋白≥100.0 g/L、WBC≥4.0×109/L、血小板≥100.0×109/L；④肝功能：ALT、AST＜正常值上限（upper limit of normal，ULN）的1.5倍，总胆红素＜1.5×ULN；⑤肾功能：血清肌酐＜1.5×ULN；⑥生存时间＞3个月。排除标准：①曾患其他恶性肿瘤；②近1个月内接受过其他药物试验的受试者；③不同意参加试验者；④严重肺部或心脏疾病病史者；⑤滥用药物或酒精成瘾者；⑥有人格或精神疾患，无民事行为能力或限制民事行为能力者。本实验通过广西壮族自治区人民医院伦理委员会审查（批准号：科研广西科技-2016-01号）。所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 血液标本使用EDTA抗凝采血管采集NSCLC患者外周血2管，每管5 mL，颠倒充分混匀，标本置于4℃冰箱保存，并在4 h内完成检测。

1.3 CTCs检测CanPatrol CTC二代富集技术（CanpatrolTMCTC技术）由益善生物技术股份有限公司提供。CTCs检测方法分2个步骤。①使用纳米过滤方法分离CTCs：过滤前使用红细胞裂解缓冲液除去血液中的红细胞，然后将细胞重悬在含4%甲醛的磷酸缓冲盐溶液中8 min，调整真空泵的压力为0.08 MPa，通过一个孔径为8µm的滤过膜截留CTCs；②基于分支DNA信号扩增技术进行RNA原位杂交（RNA-ISH）：使用RNA-ISH检测CD45、Ep-CAM、CK8/18/19、Vimentin、Twist等靶向序列，对上述所有基因进行特异性RNA探针杂交，使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色5 min，在100倍油镜下使用自动化荧光扫描显微镜对样本进行观察，根据EMT标志物确认出不同类型的CTCs。

1.4 CTCs鉴定在入组血液样本中加入特异性上皮生物标记探针EpCAM、CK8/18/19和间质型生物标记探针Vimentin、Twist进行杂交，杂交扩增后加入荧光染料Alexa Fluor594（用于标记上皮生物标记探针EpCAM、CK8/18/19）和Alexa Fluor488（用于标记间质型生物标记探针Vimentin、Twist），使用DAPI染色后在荧光显微镜下观察CTCs的基因表型。

1.5 CTCs中CCR9表达的检测56例CTCs检测阳性的NSCLC患者中40例患者进行CTC CCR9表达水平的检测，使用多重mRNA原位分析方法（Multiple mRNAin situanalysis，MRIA）检 测 CTC 中CCR9的表达，并使用荧光染料Alexa Fluor647进行标记，紫色荧光信号为CCR9表达阳性。荧光信号点数0个为无表达，1～3个为低表达，4～9个为中表达，≥10个为高表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用t检验；计数资料采用n（%）表示，组间比较比较采用χ2检。相关性分析采用Spearman相关系数。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CTCs计数与NSCLC患者临床、病理的关系NSCLC患者中CTCs阳性率为90.3%（56/62），其中I-ⅢA期NSCLC患者CTCs计数低于ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者（t=-3.426，P=0.001）。T3-T4期NSCLC患者CTCs计数水平高于T1-T2期患者（t=-2.141，P=0.039）。此外，有远处转移的NSCLC患者CTCs计数水平亦高于无转移的NSCLC患者（t=-2.558，P=0.013）。而肺腺癌与肺鳞癌患者以及CEA＜5µg/L 与 CEA＞5µg/L的 NSCLC患者 CTCs计数差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同临床、病理特征NSCLC患者的CTCs计数水平比较Table 1 CTCs levels of NSCLC patients with differentclinical and pathological characteristics

2.2 CTCs计数与NSCLC临床、病理的相关性CTCs计数与NSCLC肿瘤TNM分期、淋巴结转移、远处转移以及肿瘤大小T分期均呈正相关（P＜0.05）；但与NSCLC患者的年龄、性别、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平、临床病理类型均无相关性（P＞0.05），见表2。

表2 CTCs计数与NSCLC临床、病理的相关性分析Table 2 Univariate analysis of the correlation between CTC and clinical and pathological features of NSCLC

2.3 CTCs亚型与NSCLC临床、病理的相关性本研究发现，上皮型CTCs计数与NSCLC的TNM分期及肿瘤转移相关（P＜0.05），与肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移、CEA水平及患者性别均无相关性；而混合型CTCs计数与NSCLC肿瘤转移相关（P＜0.05），但并未发现其与肿瘤分期、肿瘤大小、肿瘤病理类型、淋巴结转移、CEA值及性别有相关性。见表3、表4。

表3 上皮型CTCs计数与NSCLC临床、病理的相关性分析Table 3 Correlations between epithelial CTC and clinical and pathological features of NSCLC

表4 混合型CTCs计数与NSCLC临床、病理的相关性分析Table 4 Correlations between epithelial/mesenchymal hybrid CTC and clinical and pathological features of NSCLC

组间差异性比较中，IIIB-IV期NSCLC患者上皮型CTC阳性率高于I-IIIA期NSCLC患者，差异有统计学意义（χ2=7.891，P=0.005）；有远处转移的NSCLC患者上皮型CTCs阳性率亦高于无转移患者，差异有统计学意义（χ2=6.147、P=0.013），见表5。

表5 上皮型CTCs阳性率与NSCLC临床、病理的关系（n）Table 5 The correlations between mesenchymal CTC positive rate and clinical and pathological features of NSCLC（n）

2.4 CTCs的CCR9阳性率及表达水平与NSCLC的临床相关性本组NSCLC患者中，40例CTCs检测阳性，并进行CCR9表达水平的检测。混合型CTCs中，CCR9阳性率仅与NSCLC远处转移相关（P=0.036）。组间差异性分析结果显示，仅在不同性别NSCLC患者间CCR9阳性率差异有统计学意义（P=0.004）；而不同病理类型、转移情况、肿瘤分期以及CEA水平的NSCLC患者CCR9阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表6。

表6 混合型CTCs中CCR9阳性率与NSCLC临床、病理的关系（n）Table 6 The correlations between CCR9 positive percentage of epithelial/mesenchymal hybrid CTC and clinical and pathological features of NSCLC（n）

3 讨 论

肺癌高危患者的筛查，首推低剂量螺旋CT扫描；但对于直径＜1.0 cm的肺部结节，CT显像不佳，患者还要承受放射性辐射与造影剂过敏的双重风险［13］。从时效性方面而言，CT检查具有滞后性；而CTCs可在肺部病变出现前6～9周表现异常。相对于有创的活组织检查而言，CTC只需简单的抽血就可检测，患者接受度、配合度更高，对因高龄、基础疾病多、一般情况差、无法确认原发病灶等各种原因而不能进行活组织检查的患者而言，CTCs可成为一项优选方案。CTCs对于肺癌高危患者的筛查有积极意义。

上皮间质化过程是肿瘤从原发病灶中脱落，侵袭进入血液循环并转移形成新病灶的重要途径，外周血中CTCs的存在亦预示着肿瘤转移的发生［14］。本研究发现，相对于无转移的NSCLC患者，具有远处转移的NSCLC患者CTCs检测的阳性率更高，且CTCs计数的平均值更大；而具有淋巴结转移患者CTCs计数亦比无淋巴结转移患者更多。这与此前Muinelo等［15］和Lim等［16］的研究结果一致。在CTCs与NSCLC临床、病理的相关性研究中，CTCs计数是NSCLC患者肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移及远处转移的相关因素。对于早期NSCLC患者而言，晚期NSCLC患者CTCs计数更多。CTCs的存在预示着NSCLC患者的预后不良。在Yang等［17］研究中亦发现，CTCs计数更高的NSCLC患者有着更短的无进展生存期（Progress Free Survival，PFS）和总生存期（Overall survival，OS），CTC可作为NSCLC患者预后预测的指标［14，18-19］。

此外，在不同CTCs分型与NSCLC临床、病理相关性的探索中，本研究还发现上皮型CTCs计数与NSCLC的TNM分期及肿瘤转移相关。IIIB-IV期NSCLC患者上皮型CTC阳性率高于I-IIIA期NSCLC患者。上皮型CTC与NSCLC患者预后相关，上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）阳性CTCs是肿瘤转移、复发的危险因素［20］。而具有上皮-间质化特征的混合型CTC有着更强的经血行转移、迁徙至远隔器官的能力，与更差的PFS及OS相关［21］。本研究发现混合型CTCs计数与肿瘤远处转移存在相关性，与此前研究结果一致。但研究中并未发现间质型CTCs与NSCLC患者临床、病理的相关性，可能与入组病例数较少及肿瘤的异质性有关，我们将继续扩大入组样本量。

外周血中CTCs计数与CTCs亚型在一定程度上与NSCLC患者疾病状态及生存预后相关。通过简单抽取患者外周血检测CTCs可推测患者的疾病状态，并及时采取相应的干预治疗措施，对改善NSCLC患者预后及延长其生存时间具有深远意义。对于组织病理学、影像学检查均提示为早期肺癌的患者，如外周血中检测到的CTC数值较高，亦需警惕是否已经发生了肿瘤的远处转移，需在接下来的随访时间里密切监测患者的状态。Ilie等［22］的前瞻性研究，对5名检测出CTCs的肺部良性病变患者进行了密切的观察随访，在随后的1～4年时间里，所有患者均发现了影像学可见的肺部结节并通过组织病理学确诊为肺癌。CTCs对肺癌高危患者的筛查及肺癌患者的随访具有重要的潜在应用价值。

而在此前的研究中已经发现，CCR9在NSCLC组织中高表达，CCR9-CCL25轴可促进肺癌细胞的侵袭与转移，并可通过上调PI3K/Akt通路产生抗凋亡作用，CCR9表达与NSCLC侵袭转移及预后相关［23-24］。本研究发现，混合型CTCs中CCR9阳性率与NSCLC远处转移相关，混合型CTCs是同时具有上皮和间质特性的肿瘤细胞，提示CCR9可能参与了肿瘤的EMT过程与混合型CTCs的产生，CCR9可能通过EMT过程促进CTCs的产生与转移，从而导致原发肿瘤向远处侵袭与转移。而CCR9在NSCLC患者中检出率高（33/40，82.5%），提示可通过CTCs检测CCR9的表达情况，而不只局限于原发肿瘤组织学活检，CTCs的CCR9有望用作评估NSCLC转移及预后的新生物学指标。

然而，CTCs在外周血中的数量十分稀少，检测费用相对高价亦影响着CTCs检测技术的推广。本研究发现了CTCs及其CCR9表达在NSCLC侵袭转移预测中的潜能，但小样本量的研究存在着推广的局限性，故今后将继续收集更多NSCLC患者信息，同时将对CTCs在NSCLC治疗疗效监测、分子分型及耐药基因突变检测等领域中的研究展开工作。