基质硬度与肝细胞肝癌的相关研究进展

汤思哲，王 仆，孔大陆

(天津医科大学肿瘤医院结直肠肿瘤科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060)

肝细胞肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤死亡率第二位[1]。虽然其治疗手段取得了很大进展，但复发率、转移率仍未下降，主要表现为肝内转移率和术后复发率高。因此，寻求新的治疗途径是提高肝细胞肝癌治疗效果的关键。人体组织中的细胞可能经历许多机械刺激，如来自血流的剪切应力或来自与肌肉活动相关的几种组织的拉伸和压缩力[2]。细胞被细胞外基质包围，而细胞外基质由许多不同的蛋白质组成，包括层粘连蛋白、胶原蛋白和纤连蛋白。通过施加牵引力，细胞能感测到细胞外基质固有的机械特性，如硬度。细胞对外力反应的能力，包括探测和解读细胞外基质的机械特性及合成和重构细胞外基质，在许多方面发挥重要作用[3]。如细胞外基质硬度在疾病状态(如癌症和纤维化)[4]或衰老[5]下会对细胞的迁移、分化和增殖产生不利影响。另一方面，细胞内异常的信号通路会影响细胞感知和响应外部机械刺激的能力，是造成癌症、纤维化发展的重要原因，同时也是导致包括癌症在内疾病的始动因素。细胞感知和响应外部机械刺激的能力被称为机械力转导。机械力转导需要感知外力或生物力学特性并将该信息向后转导，触发特定的细胞内信号响应。而细胞骨架可将不同的细胞区域(高尔基体和细胞核)连接到力感知装置，因此细胞骨架在机械转导中起关键作用[6]。现就基质硬度与肝细胞肝癌的相关研究进展予以综述，以为临床肝细胞肝癌的预防和治疗提供参考。

1 机械力转导

自机械生物学概念出现以来，机械信号已被证明几乎影响了生物学的每个过程[7]。体育锻炼、呼吸或心脏泵血等大体机械信号在一个多世纪以前就被认为会调节组织发育，而微观机械信号(如细胞产生的力或血流)对细胞黏附的影响于1980年后才得到证实[8]。随着观察和干预体外机械信号技术的出现，细胞如何感知、传递和调节机械信号机制逐渐被揭示[9]。

在细胞质中，细胞骨架由肌动蛋白、中间细丝和微管组成，其高动态支架结构是机械信号产生和调节的关键单元。这些结构成分的不断聚合/解聚，以及肌球蛋白Ⅱ诱导的肌动蛋白丝运动，是产生活性力的原因。机械力可传导至不同的通路：①通过核骨架和细胞骨架复合体直接施加在细胞核上[10]；②在膜和黏着斑上，通过整合素受体将它们传递穿过细胞膜并与细胞外基质相互作用[9]；③通过黏附连接，其中钙黏素受体可将这些力传递给邻近的细胞[11]。沿着上述力作用的轴线，机械信号通过直接的细胞-胞接触或通过细胞外基质变形传播。由于细胞骨架的相互连接结构，机械力通过局部粘连或黏附连接，故会引发几乎每个细胞器变形。细胞将这种来回形式的机械信号(力)转变为细胞内的生化信号，调整细胞的行为和(或)表型[12]。因此，机械信号可理解为信息处理过程，即由细胞外基质单元“写入”，通过“传输”并由其他单元“读取”的过程。与其他信息处理系统一样，信号转导通路的稳定性和可重复性对细胞的稳定性至关重要。机械力转导过程配备了许多正反馈回路，以完成高度复杂、精密和动态的水平分子反馈调节，故在细胞的生理及病理过程中发挥关键作用。

2 基质硬度与机械力转导

细胞内在的基因组改变和其对外在可溶性生长因子、细胞因子和趋化因子刺激的反应可产生细胞转化和肿瘤转移。肿瘤的发生和演进可概括为包含多个中间步骤的由良性表型至获得侵犯或转移特性的过程，包括特定基因的扩增或失活、肿瘤标志物的表达及细胞和组织结构的改变等。同时，这些步骤还应包括细胞和组织的力学表型。不仅包括细胞和组织结构及力学的内在变化，还包括细胞微环境的生物物理学特性改变，如细胞外基质的力学、几何学和拓扑学[13]。

组织硬度可影响许多生物学过程。人们触到肿瘤是因为肿瘤本身硬度增加[14]。而研究表明，微环境中的力学变化可促进肿瘤演进[15]。纤维性肺疾病起初为轻度组织硬度的变化，其被细胞感知后可产生更加严重、不可复的重构[16]。且细胞外环境的硬度可调控间充质干细胞的分化和造血干细胞的自我更新[17-18]。开发力学特性上可调节的支架以控制细胞行为已成为组织工程的主要任务[19]。

在肿瘤学方面，研究主要集中于细胞外基质的硬度变异如何影响组织细胞的行为。体外3D基质的生物力学特性，特别是其压力和张力，可对细胞行为产生重要影响，且可能对调控细胞和组织的行为与生物化学因素具有协同作用[20]。乳腺上皮细胞可在重构的基膜基质(Matrigel)中形成具有极性的乳腺腺泡，并可复制在体环境催乳激素刺激下发生的分化[21]。转化事件可激活细胞侵犯腺泡腔，故整个系统可作为模拟肿瘤发生的模型[20]。研究表明，在不改变其生物化学组成的前提下，增加基膜基质密度可发生乳腺上皮细胞转化[18]。其通过调节整合素和Rho激酶介导的信号通路发挥作用。这些力学改变可增加细胞生长、细胞极性消失、黏着斑增加、黏着斑激酶、vinculin和p130CAS激活，并导致细胞-细胞连接破坏从而阻止腺泡腔形成[22]。

以上研究表明，组织硬度与细胞表型关系密切，机制涉及机械力转导。机械力转导是指将物理信号转化为细胞内生物化学反应，其主要集中在已确定对力学敏感的分子，如离子通道、整合素、钙黏素、生长因子受体、细胞骨架、细胞核、胞外基质以及其他大量被认为在机械力转导反应之中发挥作用的信号分子。在物理因素的刺激作用下，上皮细胞表面的整合素是外力传向细胞骨架的通道，细胞通过其表面的整合素受体即时响应机械力以张力整合的形式将响应的力信号有选择地转换到细胞和核内的不同结构部件上，如黏着斑中的信号分子、细胞骨架结构、细胞膜上的表皮生长因子受体、离子通道、核膜孔、染色体，甚至可能是单个基因，实现力化学转化，从而调节细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移等生理功能，并引起胞形态学上的进一步变化，如极化、突起，最终导致细胞极性改变，这对维持细胞的铺展和生长，影响细胞的功能产生调控作用[23]。

3 基质硬度、肝硬化与肝细胞肝癌的关系

肝细胞肝癌发生和演进是多因素、多基因和多阶段、多途径的复杂过程，其确切分子生物学机制尚不清楚。相关遗传学异常主要包括染色体的缺失和重排、异倍体、基因突变及乙型肝炎病毒DNA整合，而表观遗传学改变主要为DNA的异常甲基化、组蛋白修饰和染色质重构等[24]。目前肝癌细胞中发现超过20种基因表达异常，且几乎所有肝癌细胞均发生多种基因和遗传位点的结构性改变，而每种特定遗传学或位点改变的影响不超过其中的半数[25]。这可能由于同时存在几种不同的致癌机制造成，而不同的致癌机制在不同危险因素下发挥作用。

发生肝细胞肝癌的主要危险因素包括病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、中毒(酒精和黄曲霉素)、代谢性疾病(糖尿病、血色素沉着症、非酒精性脂肪性肝病)和免疫相关(自身免疫性肝炎和原发性胆管硬化症)。而其中大多数危险因素可导致肝硬化的形成和演化。80%～90%的肝细胞肝癌患者合并肝硬化，肝硬化患者的5年累积肝细胞肝癌发生率为5%～30%[26]。在一些发达国家肝硬化相关的肝细胞肝癌病死率上升，而肝硬化非肝细胞肝癌并发症的死亡率在不断下降或稳定。队列研究表明，肝细胞肝癌是失代偿肝硬化肝脏相关死亡的主要病因[26]。

有研究表明，肝脏硬度与乙型和丙型病毒肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝细胞癌的肝纤维化程度有关[27]。2003年Sandrin等[28]首次引入基于超声的瞬时弹性成像技术，目前其在临床广泛应用于测量肝脏硬度。它以非侵入性方式对肝纤维化和肝硬化显示出良好的诊断性能。瞬时弹性成像技术对多期肝纤维化肝脏硬度的测量范围为12.5～75.5 kPa，其中F2期的截尾值为7.1 kPa，F3期和F4期的截尾止值分别为9.5 kPa、12.5 kPa(根据METAVIR评分系统)[29]。而应用原子力显微镜测量局部肝脏组织的硬度。在生理条件下，正常肝组织的硬度约为150 Pa，在纤维化肝中纤维胶原沉积的区域硬度增加到1～6 kPa[30]。

对于肝脏硬度产生的原因至今尚不清楚。通过用EVG(Elastica van Gieson)染色弹性蛋白显示，肝内弹性蛋白区域与肝脏硬度呈正相关，提示弹性蛋白含量可能与肝脏硬度有关[31]。此外，细胞外基质交联也可增加组织硬度，特别是赖氨酰氧化酶和转谷氨酰胺酶是细胞外基质交联过程中起重要作用的两大类酶。

肝脏硬度的增加使得肝细胞感受到更多的细胞外来力，并通过细胞表面的黏附因子将胞外信号向胞内传导。Schrader等[32]在经“基质”包被的不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶上观察Huh7和HepG2肝细胞癌细胞发现，提高基质硬度可促进肝癌细胞增殖，并证实其通过β1整合素和黏着斑激酶发挥作用。Lozoya等[33]用6种不同的水凝胶配方培养人肝脏干细胞，然后使用各种标志物分析分化程度。结果显示，这些细胞具有硬度依赖行为，表明在理想的机械环境中播种的细胞能够以干细胞生态位中观察到的相同方式进行自我组织。Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)和PDZ结合域转录共激活因子(transcroptional coactivator with a PDZ-binding domain，TAZ)是激活机械敏感通路之一。经Dupont等[34]鉴定，转录辅助因子YAP和TAZ 可作为内皮细胞和间充质基质细胞中的强大机械传感器，根据基质硬度YAP和TAZ从细胞质转移到细胞核。除机械传感之外，它们还可作为细胞-细胞黏附、细胞-基质黏附和细胞骨架信号转导下游细胞信号转导的中心节点[35]。YAP和TAZ由激酶大肿瘤抑制基因(large tumor suppressor gene，LATS)1和LATS2直接调节，YAP/TAZ磷酸化导致细胞质螯合或降解。但调节YAP/TAZ核穿梭的精确机械传感机制仍在研究中。YAP和TAZ本身缺乏DNA结合结构域，其主要通过TEA结构域因子TEAD1～4，以及通过与几个直接参与纤维化的转录因子家族(SMADs和β联蛋白)的相互作用介导转录效应[36]。在上皮细胞中，YAP和TAZ介导细胞存活信号转导，赋予干细胞分化并参与修复过程，促进间充质转化，并在肿瘤发生中发挥作用。近年针对肺、肝、肾以及真皮的成纤维细胞研究发现，YAP和TAZ在激活这些细胞向促纤维化转化中起保守和关键作用[37-42]。以上研究表明YAP和TAZ在纤维化级联中的核心作用。由于YAP和TAZ在许多器官和组织环境中广泛表达和具有重要生理作用，所以这对该途径的阻断性靶向治疗的合理性及安全性提出挑战。此外，Rho/Rho激酶信号可能是机械和受体介导的YAP和TAZ激活的关键上游调节因子[43]。ROCK抑制剂在临床前纤维化模型中的阳性结果表明，YAP/TAZ激活至少部分受到了抑制[44]。而对YAP /TAZ遗传和分子靶标进行的选择性抑制剂的探索将提供新的治疗途径，进一步阻断纤维细胞活化的机械受体转导途径。其中，YAP和TAZ抑制靶点的选择是实现治疗价值至关重要的步骤。

4 小 结

机械力转导包括硬度反应途径在调节基本细胞功能中起重要作用。机械力的重要功能之一是重构细胞形态。细胞反复感知周围微环境的变化，通过许多机械力敏感过程联合细胞状态实现细胞的极性分化。事实上，形态是由微环境决定的，是通过激素、内部时钟和受体酪氨酸激酶的响应来实现。而实验性条件(基质的构成和硬度)的可控性及可操作性，为今后的研究奠定了重要基础。最近定义的刚性(硬度)传感过程，为深入研究细胞如何反复感知其微环境变化与癌细胞转化提供了良好示例。另一方面，CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术进步也促进了在体方法的发展。条件性敲除和在各种模式生物体中引用突变体能快速了解细胞-细胞外基质机械性质变化的相关性及在健康和疾病中的感知方式。 到目前为止，学者已在果蝇模式生物体中发现了很大一部分机械力转导中的相关性[45-46]。虽然简单的模式生物在揭示体内相关性方面非常有用，但CRISPR技术的进步可促进哺乳动物的体内研究。目前只有少数研究开始阐明这些机械力转导事件，但随着遗传和生物物理工具的不断成熟，其将为如何将机械力转导途径整合到生理和病理生理细胞和组织过程提供新方向。