高通量测序在多原发肺癌的诊断及解码肺癌进化的价值

鲍 轶 莫娟芬

近年来随着临床影像学技术的进步及低剂量CT对肺癌高危人群筛查的应用，肺部多发结节、肿块检出的现象有增多趋势。根据2013年《新英格兰杂志》报道，通过低剂量CT对高危人群的筛查，使肺结节的发生率由8%增加至51%，而且肺癌病死率下降20%[1]。现有研究报道同时性多原发肺癌的发生率在0.2%～8.0%[2]。本文回顾高通量测序在多原发非小细胞肺癌诊断中的价值，并探讨通过对多个原发癌灶全外显子测序，对获取非小细胞的进化机制，为更好的解码肺癌生物学信息奠定基因，并为预防肺癌的发生及靶向精准治疗，延迟患者的生存提供依据。

一、多原发肺癌的定义

多原发肺癌(MPLC)是指在同一个患者肺内出现两个或两个以上的原发性恶性肿块，部位可以位于同侧肺或两肺，时间上可以是同时发现,被称为同时性多原发肺癌(synchronous multiple primary lung cancer, sMPLC)，或者是异时检测出且距首发肺部恶性肿块诊断时间间隔超过2年,临床称为异时性多原发肺癌(meterochronous multiple primary lung cancer, mMPLC)[2]。MPLC需在术前与肺癌伴肺内转移做出鉴别，因为根据目前TNM分期标准，同肺叶的伴同时性原发卫星结节，诊断为T4(临床分期ⅢB期),而原发恶性肿块在一侧肺叶，而转移病灶不同肺叶则认为是转移性病灶(临床分期为Ⅳ期),这与多原发肺癌，特别是sMPLC的处理方法是完全不同的[3]。不过实际诊治过程中，往往是通过手术后病理标本的获取，做出最终的诊断。

非小细胞肺癌是较为高发的肺癌病理类型，特别是近年来肺腺癌高发，多原发肺腺癌比例也呈现递增趋势。对于肺鳞癌，长期吸烟史是重要的发病机制，吸烟影响支气管树的不同敏感细胞后形成肺的浸润性癌，可以同时或序贯发生，异时性原发性肺鳞癌的发生可能是多处肺组织因不断暴露在吸烟等致癌性刺激下的结果[4]。目前肺腺癌的致病因素并不是很清楚，很多女性患者并没有吸烟史，因此从分子水平研究多原发肺腺癌，不仅对于明确鉴别不同肿块的性质，而且可以通过分子学水平对肺内多发性肺癌进行研究，找到肺腺癌可能的发病机制。

二、多原发肺癌的病理学诊断

多原发肺癌需与多原发肺癌与肺癌伴肺内转移区分，在术前准确评估。根据Martini-Melamed的诊断标准，各个癌灶间彼此孤立，包括位于不同的肺段、或肺叶，各癌灶共同引流区域无肿瘤细胞累计，且无纵膈淋巴结及无远处转移。对于mMPLC，病理组织学类型相同时，无瘤间期至少2年，或均由不同的原位癌起源，或第2原发癌位于不同肺叶或不同侧肺时，肺癌共同的淋巴引流部位无癌细胞累及，确立第2原发癌时无肺外转移[5]。不过美国胸科医师协会(ACCP)2013年对mMPLC的诊断标准指出对于第2原发癌组织类型相同时，时间间隔需不少于4年，若时间在2～4年则不能确定是mMPLC 还是肺癌的肺内转移[6]。不过临床实践中仍然可能会存在同时或异时性原发性多难以肺癌伴肺内转移进行鉴别，导致诊断延误及治疗方法错误。近年来分子生物学技术已经开始从基础实验室向临床转化应用，分子诊断学成为肿瘤诊断、预后判断及筛选合适人群使用靶向药物的必不可少的方法学。因此通过分析各癌灶的分子遗传特征，帮助鉴别MPLC和肺癌伴肺内转移，减少误诊的发生。

三、高通量测序在多原发肺癌中的应用

高通量测序(high-throughput sequencing)，又称二代测序或下一代测序(next-generation sequencing technology，NGS)是近几年来发展最为有价值的分子诊断技术之一，具有通量高、速度快、样本量少、敏感度高等优点，目前已经被许多临床实验室开始用于遗传性的胚系突变(germline)和获得性的体细胞(somatic)基因突变的检测[7]。细胞突变检测可包括目标区域测序、全外显子组(whole exome)、全基因组(whole genome)或线粒体DNA测序等，其中全外显子测序是通过发现与蛋白质功能变异直接相关的遗传突变，因此相对于全基因组测序费用会更低，数据更易于分析[8]。特别是针对特定疾病设定可行的目标区域的测序基因，分析检测某些基因存在点突变(single nucleotide changes)、 插入或缺失不同数目的拷贝数(insertion or deletion of varying sizes copy number variations)、 重排(translocations)等，是疾病的诊断、用药指导及预后判断更为可行方法[9]。

2016年中国临床肿瘤学会(CSCO)发布了《二代测序技术临床应用共识》，通过国内临床肿瘤学专家、生物信息学专家、病理学家等多个领域专家，对NGS的技术应用现状、检测内容、样本处理、测序流程、数据管理、信息学分析、结果报告解释等多个方面内容进行了详细的阐述,这对临床规范和有效应用高通量测序有着重要意义[10]。根据中国临床肿瘤学会《二代测序技术临床应用共识》，目前肺癌推荐需要检测的基因包括表皮生长因子受体(EGFR)、kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(K-RAS)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROS1)、间质上皮转移因子(MET)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)。

前期笔者对多例临床存在多个癌灶肺癌的患者进行术后病理组织分子诊断分析，通过采用Illumina公司设计并商品化的TruSight Tumor 15(美国Illumina Inc公司)，检测甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织中15种常见基因突变，除了ALK，TruSight Tumor 15包括了中国临床肿瘤学会要求的肺癌做的全部基因以及P53,通过分析各癌灶的分子遗传特征，可以作为病理诊断的辅助手段，帮助区分与肺癌伴肺内转移之间的差异，减少误诊的发生。而EGFR对亚洲人群来说可能是最重要的分子生物学标志物之一来鉴别多原发肺癌，而最近的一项来自中国的研究，通过分析多发磨玻璃样肺癌结节中EGFR18-21号外显子热点突变，发现38个配对样本中EGFR突变的差异率在92.1%[11]。而另一项研究入组了37例多发肺癌手术患者，根据Martini-Melamed诊断标准诊断多原发肺癌或肺癌伴肺内转移，对配对样本采用二代测序，通过选择20个与肺癌密切相关的基因进行检测，对临床病理无法判断肺癌伴肺内转移，通过配对癌灶组织基因组突变分析，由于存在多个基因相同突变而诊断为肺癌伴肺内转移，因此认为高通量测序可以作为传统病理诊断有益的补充[12]。不过对于多原发肺癌可行的目标区域测序的基因组的选择，找到较为全面并符合特定人群的基因组，用于帮助MPLC诊断，还需要后续更多大样本的深入研究及共识讨论[13]。

四、多原发肺癌生物学信息分析对解码肺癌进化机制的研究

实际上多原发肺癌进化及各克隆灶的形成是一个长期复杂的过程，理论上多原发肺癌的克隆性形成一般是基于癌基因或抑癌基因发生体细胞突变，如P53点突变、X染色体失活分析或杂合性丢失(LOH)等。因此应该存在某一个或多个基因标志物，独立且突变率发生较高，并且出现较早且贯穿于整个过程，而在肺癌进化过程中各克隆产生了不同的体细胞突变。由于抑癌基因P53的突变在肺癌中十分常见，且大多是点突变，在非小细胞肺癌中(NSCLC)高达50%，可能符合多原发肺癌标志物的要求[14,15]。另外，X染色体基因失活(X-inactivation)也可用于检测克隆与肿瘤间的联系，不过这种技术仅用于女性患者[16]。杂合性丢失(LOH)为一个多态位点从种系杂合性到纯合性的转变，丧失一个等位基因标志。LOH分析方法是依靠单核苷酸多态性和微卫星基因型的比较或肿瘤DNA样本和病例匹配正常非瘤组织中获取DNA样本的比较[17]。2017年在《新英格兰杂志》发表了一项大样本的非小细胞肺癌(可切除的ⅠA至ⅡA期NSCLC患者)的研究报道，通过对327个区域进行了全外显子组测序发现 EGFR、MET和BRAF突变大部分属于早期突变和克隆性突变，而参与DNA损伤修复等维持基因组完整性的基因，如PIK3CA、NF1、TP53和Notch在75%以上的肿瘤发生突变，并且时间轴上发生较晚，另外CDK4、FOXA1和BCL11A的扩增，基因拷贝数的异常导致染色体不稳定性，这与肿瘤复发有着重要的相关性[18]。笔者前期通过1例确诊为早期多原发肺腺癌的患者，去除胚系突变后发现不同的癌灶中均表达较高突变率的ERG同位点突变。ERG 属于ETS家族融合基因，而 ETS-相关基因属于E-26转化(ETS)家族的转录因子, ERG融合基因激活是引起前列腺癌的发生和发展最为普遍的基因改变，而早期肿瘤中高频率的ERG突变，可能提示多克隆灶在肺癌早期在相同的致癌环境，产生了某一个或多个基因的高频点突变[19]。因此通过全外显子测序，对肺癌克隆的进化机制的阐明，起着关键作用，而通过多原发肺癌各配对癌症进行二代测序研究无疑对肺癌的发生的异质性、演变、治疗及耐药等均具有重要意义。鉴于目前无大样本后续研究，这将是今后研究热点之一。

综上所述， MPLC 与肺癌伴肺内转移在临床治疗及预后有显著不同，需要在术前和术后做出准确判断。对于高通量测序临床使用，可以获取不同肿块的分子病理信息，作为“精准医学”手段可用于辅助传统的病理组织学诊断。通过深入研究，后续用于MPLC诊断的高通量测序基因组将会有统一的指导意见，并应用于临床实践。