HepaRG细胞在药物代谢相关研究中的应用进展*

李洪芳，孙树森，张涛，唐富山

(1.遵义医科大学药学院临床药学教研室，遵义 563006；2.遵义市临床药学重点实验室，遵义 563006；3.美国西新英格兰大学药学与健康科学学院，马萨诸塞 01119)

药物代谢是在多种代谢酶参与下药物结构的改变、药理作用发挥或终止及毒性物质清除的重要体内过程，在药物开发及临床前预测药物相互作用研究中具有重要的意义。在临床实践中药物的药动学相互作用可发生在药物体内过程吸收、分布、代谢和排泄的任意环节，其中药物代谢相关的相互作用发生率最高，可占药动学相互作用的40%[1]，药物代谢是临床药学领域的研究热点之一。过去曾主要以啮齿类动物及犬、猴等作为模型模拟人的体内环境研究药物代谢，但种属差异会影响实验结果的参考价值[2]。原代人肝细胞(primary human hepatocytes，PHH)被认为是研究药物代谢体外模型的金标准。但是分离的PHH存在细胞培养困难、早期表型改变、代谢酶活性维持时间短、供体间差异大等缺点，限制了其作为体外药物代谢研究模型的实用性和可靠性[3]。人肝细胞HepG2细胞系是一种易获得的体外药物代谢研究模型，可用于胰岛素抵抗模型研究及防治胰岛素抵抗活性的中药有效部位的筛选[4]，也用于研究药物毒性作用及机制研究，但缺乏肝特异性功能[5]。HuH7细胞在早期用于药物代谢和毒理学研究，该细胞也同样缺乏相关的肝特异性功能[6]。HepaRG 细胞系是GRIPON等[7]在2002年对乙型肝炎病毒感染人肝癌细胞系研究中发现的，并首次从慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌女性患者体内的非瘤组织分离出来的细胞株，在2%二甲亚砜(DMSO)存在下可分化为肝细胞形态和胆管样结构，表现出与人肝细胞基本一致的功能，如药物代谢CYP酶系及药物蛋白转运体等。当HepaRG 细胞高分化为肝样细胞后，表达成熟肝细胞标志物——醛缩酶 B(aldolase B)，其mRNA 表达水平是新鲜分离人肝细胞的20%，而在HepG2细胞中则检测不出[8]。大量研究表明HepaRG细胞是替代人肝细胞用于体外药理学和毒理学研究的合适模型[9-10]。笔者主要综述HepaRG细胞基于药物代谢在体外模型构建、药物代谢机制、药物相互作用及毒理学等研究中的应用进展。

1 HepaRG细胞作为药物代谢体外模型的研究进展

1.1HepaRG细胞作为药物代谢体外模型比较优势 HepaRG细胞在分化阶段表达肝特异性功能(如CYP酶、转运蛋白及核受体)是替代PHH研究体外药物代谢的合适模型。在HepaRG细胞、人肝细胞和HepG2细胞中评估药物代谢酶(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、尿苷5'-二磷酸葡糖醛酸基转移酶[UGT]和磺基转移酶[SULT])的活性研究中发现除了SULT外，HepaRG细胞中酶的活性与人肝细胞中相似，并且远高于HepG2细胞中酶的活性；毒理学研究中也发现黄曲霉毒素B1和环磷酰胺对HepaRG细胞基因表达的影响比HepG2细胞中更显著[11]。由HepG2细胞演化而来的C3A细胞与HepaRG细胞比较中发现HepaRG细胞表现出更多的器官表型，包括CYP3A4的表达，使用LC-MS/MS和HPLC对非那西丁(CYP1A2)和睾酮(CYP3A4)药物的代谢物进行分析，结果显示HepaRG细胞具有更为完整的药物代谢酶[12]。此外，有研究者选择14种具有导致肝损伤的药物，分别处理L-02、HepG2、HepaRG和hiHeps 4种细胞后发现：HepaRG细胞中比其他3种细胞更能明显观察到氧化应激、线粒体损伤和脂质代谢紊乱的改变；天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的升高均与双氯芬酸钠和盐酸丁螺环酮导致的肝细胞毒性作用有关[13]，后者与临床实践中的结论一致。在上述的体外模型比较中HepaRG细胞表现出与体外人肝细胞在代谢酶表达甚至代谢效应方面更高的相似度，是体外药物代谢与毒理学体外研究中相对而言更为合适的人肝细胞替代模型。

1.2对HepaRG细胞三维培养的探索 目前HepaRG细胞体外培养多数是在二维(2D)环境下，不能很好模拟药物在人体内的处置环境，同时2D环境下体外培养的细胞模型也存在很多的缺陷。如2D环境下培养的PHH，它表现出明显的功能变异、生命周期和生长活性的有限性及药物转运体活性降低[14]。因此需要在细胞水平上探索更接近人体内环境的体外药物代谢模型。MALINEN等[15]使用纳米原纤维素和透明质酸明胶水凝胶构建的三维(3D)培养支架培养未分化的HepaRG细胞，发现可诱导细胞形成肝细胞极性和功能性胆小管样结构的3D多细胞球体即肝细胞标志物，并在3D多细胞球体的小管膜上发现肝胆药物转运蛋白MRP2和MDR1的表达。有文献报道在3D旋转生物反应器中培养HepaRG细胞模拟3D环境，并评估了CYP酶(CYP1A2、2B6、2C9和3A4等)和药物转运体UGT的活性，同时用HepaRG细胞测试药物对乙酰氨基酚(APAP)的肝毒性，结果显示酶活性及药物的肝毒性与PHH的表现相似[16-17]。在众多的模型研究中HepaRG细胞的分化都离不开高浓度DMSO的存在，而DMSO对药物代谢研究是否存在影响尚不清楚。为此，有学者研究在DMSO不存在的藻酸盐微囊化条件培养3D HepaRG细胞，观察到HepaRG细胞中肝样细胞与胆管样细胞的比率达到了2.9：1；与2D培养环境相比，肝细胞分化改善了35.9%、白蛋白和氨基甲酰磷酸合成酶I的表达更高并具有极化的球状体组织，有效扩展了HepaRG细胞的应用[18]。在半乳糖残基-藻酸盐支架中培养的HepaRG细胞也观察到与文献[18]类似的结论[19]。综上所述，3D培养比2D培养更有利于促进HepaRG细胞的分化、改善细胞形态、肝标记物的表达及代谢酶的活性，3D培养的HepaRG细胞可模拟接近药物在人体内肝脏对药物的处置环境，是更适合于体外药物代谢和新药开发的研究模型，有关3D培养的材料和手段尚有待进一步研究开发。

2 HepaRG细胞在药物代谢研究中的应用

HepaRG细胞在加有2%DMSO的培养基中分化为明显的肝细胞形态和胆管样结构，细胞开始融合时可稳定表达CYP1A2、2B6、2C9、2E1和3A4等酶活性，当HepaRG 细胞开始增殖分化成肝样细胞时，药物代谢酶的表达水平与PHH相似；但DMSO不存在时，HepaRG细胞中CYP3A4的表达水平迅速降低，CYP1A2，CYP2B6和CYP2C9的表达也可观察到类似的结果[3，8]。HepaRG细胞中CYP酶的表达和活性可维持超过4周，并发现CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4可被奥美拉唑、苯巴比妥和利福平等酶诱导剂所诱导[20]。LUBBERSTEDT等[21]评估PHH和HepaRG细胞的肝细胞特异性参数，结果显示半乳糖/山梨糖醇消除速率和白蛋白的产生在HepaRG细胞中更高。HepaRG细胞在早期分化过程中就表达一些肝特异性CYP酶，如CYP4F3B、CYP4A11、CYP4F2和CYP4F12，这些酶能通过下调脂质代谢基因调节因子的表达参与脂肪代谢，当用饱和、单不饱和或多不饱和脂肪酸处理HepaRG细胞时，CYP4F3B和CYP4A11表达保持不变，而CYP4F2和CYP4F12的表达上调[22]。药物的代谢不但涉及I相药物代谢酶，还需II相药物代谢酶的参与。有文献已经报道在分化的HepaRG细胞中谷胱甘肽转移酶GSTA1/A2、 GSTA4、 GSTM1、UGT1A1和UGT2B7的mRNAs表达水平与PHH相似，此外各种核受体如芳香烃受体(AHR)、孕烷X受体(PXR)、组成型雄甾烷受体(CAR)及过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)也有相似的表达[23]。硫丹和甲氧氯是PXR和CAR两种核受体的激活剂[24-25]，它们的主要代谢途径涉及CAR和PXR调节的CYP3A4和CYP2B6酶[26]。使用硫丹和甲氧氯处理HepaRG细胞发现两种化合物均增加CYP3A4和CYP2B6 mRNA水平，也能与人肝细胞中的其他外源性物质相互影响[27]。用利福平处理HepaRG细胞后，利福平诱导的CYP3A4、2B6和2C9加快美托洛尔的α-羟基化，O-去甲基化和N-脱烷基化，由此证实参与美托洛尔代谢并非只有CYP2D6酶，同时也解释在人体内观察到利福平治疗后美托洛尔和α-OH-美托洛尔比率的降低[28]。药物代谢酶CYP3A4是临床上绝大多数药物的代谢酶之一，也被认为参与了生物毒素冈田酸(OA)的代谢。在没有CYP3A4抑制剂的情况下，用OA处理HepaRG细胞系可检测出两种单羟基化的代谢产物，而在CYP3A4抑制剂存在的情况下则检测到代谢产物，此研究表明CYP3A4激活时OA的细胞毒性降低，而羟基化是OA代谢的关键环节[29]。

3 HepaRG细胞在药物相互作用研究中的应用

在临床实践中联合用药是很常见的，这导致药物与药物、药物与食物之间发生相互作用的机会增加，其中药物对相关代谢酶如CYP酶的诱导或抑制被认为是药物发生相互作用的重要因素。HepaRG细胞是替代PHH体外药物代谢研究的合适模型，已有文献报道HepaRG细胞模型用于药物代谢相关的药物相互作用研究。用利福平和苯妥英作为诱导剂及胺碘酮作为底物，该研究首次用HepaRG细胞作为体外药物代谢模型验证了利福平和苯妥英是胺碘酮的强诱导剂[30]。PXR和CAR两种核受体调节CYP酶表达导致的药物相互作用越来越受到人们的关注。在临床上常用的甲硝唑与华法林联合用药导致患者脑出血或凝血酶原时间延长被认为是甲硝唑增加华法林的血药浓度[31-32]。使用甲硝唑和华法林处理HepaRG细胞后发现CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4和CARmRNA的表达水平降低，该研究结果表明甲硝唑通过下调调节CYP2C9表达的核受体CAR，而导致其mRNA表达水平的降低[33]。HepaRG细胞中存在转录因子CAR、PXR、PPARα、AHR、类视黄醇X受体(RXR)及CYP酶可作为体内CYP诱导预测的体外模型。文献报道在HepaRG细胞中CYP3A4、2B6和2C9被利福平诱导后美托洛尔代谢加快，表明利福平诱导这些酶的活性。此外，HepaRG细胞中CYP2B6、CYP1A2和CYP3A4的活性也可分别被苯巴比妥、奥美拉唑及利福平所诱导，跟临床实践中的结论一致[28，34]。冬凌草甲素是从植物冬凌草叶子中提取的二萜类化合物，具有抗肿瘤活性和抗氧化功能而被广泛应用，但对CYP450s mRNA和蛋白质表达的影响乃不清楚。据报道，用冬凌草甲素处理HepaRG细胞系后发现其能够诱导CYP3A4和CYP2C9酶的活性及mRNA水平增加的作用[35]，该研究结果提示在临床上应谨慎使用以避免潜在的药物相互作用。HepaRG细胞还可以应用于芦苇提取物改善多西他赛诱导的骨髓毒性作用的研究，但是其具体的活性成分和机制尚需进一步的研究[36]。

4 HepaRG细胞在药物代谢相关毒理研究中的应用

4.1在药物肝毒性研究中的应用 肝脏是人体重要的解毒器官，药物经过肝脏代谢后可使药物代谢活性增强、前体药物药理作用激活和毒性物质产生等，某些药物的肝毒性与其在肝脏中的代谢密切相关。过去对乙酰氨基酚(APAP)肝毒性的机制研究较多，但大多数都是用啮齿动物模型和PHH进行肝损伤的机制研究，其中啮齿类动物与人类之间存在种属差异，不能准确预测药物在人体内的肝损伤机制。当用不同浓度APAP处理HepaRG细胞后，发现细胞中的APAP-蛋白质结合物形成、细胞溶质钙升高、线粒体氧化应激和过氧亚硝酸盐形成、线粒体功能障碍和乳酸脱氢酶(LDH)释放及谷胱甘肽化导致的能量代谢缺失，而LDH释放的时间过程与APAP在人体过量后血浆氨基转移酶活性的增加类似[37]，该研究的结论验证了APAP在人体内肝毒性的机制，同时也提出了一些新的见解，而谷胱甘肽化的机制则是继发于共价结合[38]。戊唑醇是三唑类杀菌农药，在啮齿动物研究中发现可引起肝毒性，在体外HepG2和HepaRG细胞中对戊唑醇毒性的分子机制研究发现戊唑醇可通过激活AHR受体诱导CYP1A1和CYP1A2的表达[39]。以牛磺酸处理HepaRG细胞的研究发现细胞的粘附力明显下降、细胞死亡和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3显著增加，表现出一定的剂量依赖性；并且大剂量应用牛磺酸还能致使血清谷氨酸脱氢酶和白细胞介素(IL)-6的分泌增加，这表明牛磺酸可以引起对肝细胞的直接毒性作用导致肝损伤[40]。

4.2在细胞毒性及遗传毒性研究中的应用 药物经肝脏代谢后可能会产生毒性或毒性物质直接损伤细胞，这也是药物开发和临床合理用药要考虑的重要问题。用芦荟大黄素处理HepaRG细胞后可致细胞中活性氧(ROS)产生，线粒体膜电位去极化，线粒体细胞色素C释放，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、-8和-9裂解，Fas、p53、p21表达水平和Bax/Bcl-2比值增加；此外它还通过增加p21和细胞周期蛋白E的表达诱导细胞停滞于S期和降低细胞周期蛋白A及细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达，从而以剂量和时间依赖性方式降低HepaRG细胞的活力和诱导其凋亡[41]。海洋单细胞藻类的代谢产物亲脂性贝类毒素(OA、DTX-1、DTX-2和PTX-2等)会导致严重的食物中毒。在HepaRG细胞实验发现这些贝类毒素能够诱导细胞凋亡和DNA链断裂具有很强的细胞毒性，尤其是PTX-2和DTX-1还诱导HepaRG细胞中CYP3A4增加基因毒性标记物水平[42]。HepaRG细胞在毒理学研究中广泛用于肝毒性、细胞毒性及遗传毒性等的研究，可用于临床药物毒性的筛选。

5 HepaRG细胞基于药物代谢的其他应用

HepaRG细胞在药物胆汁淤积及磷脂过多症等研究中已有一定的报道。BURBAN等[43]以HepaRG细胞研究发现3种耐酶青霉素均可引起细胞胆汁淤积，其机制主要与依赖早期内质网应激触发的ROS产生及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性的增强有关。其他学者也以HepaRG细胞研究了波生坦、环孢素、氯丙嗪和曲格列酮等具有相似的药物胆汁淤积机制研究[44-45]。药物导致磷脂过多症临床常见，用氯雷他定处理HepaRG细胞，发现氯雷他定代谢物的激活会导致磷脂在细胞中沉积[46]。法呢醇(FOH)可调节脂质代谢和降低啮齿类动物肝脏三酰甘油含量，用FOH处理脂肪肝HepaRG细胞模型发现它通过增加脂肪酸氧化降低细胞中的三酰甘油含量，并推测可能是PPARα受体介导的线粒体脂肪酸氧化诱导[47]。

6 结束语

HepaRG细胞具有表达I相药物代谢酶CYP酶、Ⅱ相药物代谢酶、转运蛋白及核受体等肝特异性功能的潜力。在DMSO存在下分化为肝样细胞和胆管样细胞并稳定表达CYP1A2、2B6、2C9、2E1、3A4等酶活性及肝特异性标记物，其CYP酶的mRNA表达水平与PHH相似，能在体外于较长时间内保持酶活性及蛋白转运体功能，被广泛认为是替代PHH用于体外药物代谢相关的药物代谢机制、药物相互作用及毒理学等研究的合适模型。但HepaRG细胞培养中所需的高浓度DMSO、细胞培养周期长以及该细胞的来源性别是否会影响细胞模型基因的表达，目前的研究尚无共识，需要深入研究[48]，三维培养也许是部分解决DMSO问题的途径之一；另外关于药物相互作用在HepaRG细胞中应用的文献报道较少，且多是验证性研究，需要进一步系统研究。