线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中的研究进展

颜思阳，陈 瑶，周德生，郭 纯，刘利娟※

(1.湖南中医药大学研究生院，长沙 410208； 2.湖南中医药大学第一附属医院a.神经内科，b.中心实验室，长沙 410007)

脑卒中已成为世界上致死和致残的第二大原因[1-2]，其以突然发病的神经功能缺损为特征。而缺血性脑卒中约占全部卒中的69.6%，占脑卒中发病率的第一位，也是脑卒中死亡的首要原因[3]。据统计，缺血性脑卒中的发病率为91.3/10万～263.1/10万，年平均发病率为145.5/10万，复发率为8.47%[4]。目前，急性脑梗死的治疗[5]包括静脉内使用重组组织型纤溶酶原激活剂、血管内机械取栓等，其治疗目标均为使缺血的脑组织恢复血液供应，临床亦称之为再灌注。然而，虽然缺血脑组织氧气供应的恢复有一定益处，但快速再灌注对脑功能可产生有害作用，即再灌注损伤。因此，脑梗死的理想治疗策略是恢复缺血组织的氧气供应，同时尽量减少再灌注损伤。作为缺血后神经细胞死亡的关键靶区，线粒体与脑缺血再灌注损伤关系密切，其功能紊乱是脑缺血再灌注中细胞损伤的关键。脑缺血损伤中受损的线粒体可通过自噬活动被选择性清除[6]。但研究证实，线粒体自噬是一把双刃剑，即适当的线粒体自噬有助于保护神经细胞，而线粒体自噬失调或过度可能是有害的[7]。现就线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中的研究进展予以综述。

1 线粒体自噬

线粒体是细胞内的关键细胞器，被誉为细胞的动力工厂。除能为细胞提供能量外，其还参与了多种重要细胞活动。Lemasters[8]于2005年首次提出线粒体自噬这一概念，其指细胞为维持正常生理过程，进化产生的一种利用自噬活动选择性清除损伤线粒体的机制，这一机制可能具有减少由衰老引起的线粒体DNA突变的作用。线粒体自噬可以控制线粒体的数量使之与新陈代谢的需求相匹配，同时也是一种对受损线粒体的清除和控制手段。

1.1线粒体自噬相关蛋白 研究发现，在脑缺血再灌注过程中线粒体自噬受多种蛋白的调节，包括第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物诱导的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa-interacting protein 3,BNIP3)等[9-11]。而在哺乳动物细胞中，存在两种与线粒体自噬调节机制相关的信号转导途径，即PINK1/Parkin依赖途径[12]和PINK1/Parkin非依赖途径[13]。其中在不依赖PINK1/Parkin的线粒体自噬中，BH3-only促凋亡蛋白、BNIP3和FUN14结构域包含蛋白1尤为重要[14-16]。线粒体自噬相关蛋白在线粒体自噬途径中作用于不同的节点，或单独或互相作用，在一定程度上调控自噬的发生。

1.2线粒体动力学调控的线粒体自噬 线粒体动力学在调控线粒体自噬时发挥了重要作用。为维持其功能的完整性，线粒体参与了多种动态活动，如生物的发生、融合、裂变、转运和自噬。同时，细胞的能量状态与特定的线粒体形态相关。线粒体动力学(融合/裂变)和线粒体自噬是维持线粒体功能和能量稳态的两个关键细胞过程[17-19]。它们的适当调节有助于细胞存活；相反，两者不平衡将导致细胞死亡。线粒体分裂是脑缺血后早期神经元死亡的上游事件[20-22]。有研究证明，短暂的全脑缺血会诱导大鼠海马CA1区线粒体的动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)短暂增加[23]。这一发现强化了线粒体动力学在缺血诱导的神经元死亡中的重要作用。除分裂和融合外，线粒体膜电位在线粒体自噬中也扮演了重要角色。研究证明，PINK1和Parkin能够介导多种细胞的线粒体自噬，且更倾向于介导去极化线粒体的清除[24]。当PINK1识别受损的线粒体时，它可以稳定地积聚在线粒体外膜表面充当生物传感器[25]。其激酶活性和结构的完整性是诱导Parkin易位至受损线粒体，进而激活线粒体自噬的主要条件。此外，PINK1和Parkin的平衡和相对活性也决定了线粒体膜电位的重建和电子传递酶的效率，以避免线粒体自噬过度而造成健康的线粒体损伤[26-27]。另有研究发现，线粒体DNA损伤、线粒体毒性、线粒体蛋白修饰和病毒性感染均会激活线粒体自噬[28]。

2 线粒体自噬与脑缺血再灌注损伤

脑缺血再灌注损伤是一极为复杂的病理生理过程，呈快速的级联反应，包括神经细胞内钙离子超载、脂质过氧化、氧自由基损伤、凋亡基因激活、兴奋性氨基酸的细胞毒性作用、炎性细胞因子损害等[29-31]。这些病理反应引起的线粒体功能紊乱、炎性损伤及细胞损伤等多种机制在脑缺血再灌注损伤进程中扮演不同角色。研究表明，脑缺血再灌注中线粒体损伤及功能紊乱是造成神经细胞死亡的重要原因[6]。线粒体自噬作为一种清除受损线粒体的途径，在脑缺血再灌注中起重要作用，但目前尚有争议。自噬可以在缺血预处理中起保护作用，但一旦发生缺血再灌注损伤就会产生不同的作用[32-33]。在缺血再灌注14 d后线粒体自噬受到抑制，而复方脑肽节苷脂注射液能通过激活线粒体自噬改善脑缺血再灌注损伤[34]。脑卒中后的一些病理生理反应，如重度高血糖可通过抑制线粒体自噬的激活，阻碍急性缺血早期内源性受损线粒体的清除，致使受损线粒体发生堆积，进而扩大线粒体介导的下游凋亡损伤，加重大鼠的脑梗死损伤程度[35]。但也有研究发现，脑缺血再灌注后BNIP3的表达增加，其造成线粒体自噬过度激活，引发迟发性细胞死亡，加重脑缺血再灌注损伤[36]。另有研究发现，缺血后6 h尾静脉注射肌肽能通过抑制自噬和线粒体自噬的激活，来达到抑制自噬性细胞死亡和保护缺血再灌注损伤的目的[37]。虽然线粒体自噬作在脑缺血再灌注损伤中所起的作用一直存在争议，但能够确定的是受损线粒体的过度清除和清除不足均将导致细胞死亡[38]。

2.1能量代谢障碍 线粒体通过氧化磷酸化为大多数细胞产生ATP，在生理条件下通过复合物Ⅰ～Ⅴ产生超过95%的细胞能量[39]。在几乎所有的脑卒中动物模型中，氧化代谢均受到葡萄糖和氧缺乏的影响，这会迅速改变ATP和其他主要与线粒体有关的能量相关代谢物[40]。在线粒体基质中，三羧酸循环、氧化磷酸化等均与能量代谢相关[41]。在脑缺血再灌注中，线粒体的能量代谢可通过各种机制改变。在病理条件下，缺血半暗带中的大多数细胞在缺血2 h后仍然存活，而葡萄糖和ATP水平显著降低，且磷酸肌酸水平降低至非缺血时的约70%[42]。相反，缺血时无氧糖酵解间接增加并产生大量乳酸，使细胞内pH降低，导致多种细胞内酶的活性降低或丧失[43]。此外，葡萄糖代谢的减少可导致丙酮酸氧化增加[44]，影响乙酰辅酶A的活化，并引起三羧酸循环的持续激活[45]，导致线粒体能量代谢异常。而再灌注能部分地恢复脑内血流，并将葡萄糖利用率降低到缺血核心的正常范围的一半左右[46-47]。同时，它还使ATP的水平较磷酸肌酸或腺苷酸能量电荷恢复得更慢。

2.2氧化应激过度激活 维持线粒体功能的正常对细胞功能的正常发挥至关重要。对于由高能量需求的神经元细胞，氧化磷酸化过程极为重要。但是，线粒体的氧化磷酸化过程会伴随活性氧类的产生。正常情况下，机体内产生的适量活性氧类可作为信号分子参与细胞生长发育、免疫等[48]。但当发生脑缺血后，脑血流的急剧减少导致氧糖缺乏，从而引起线粒体结构异常，氧化磷酸化发生障碍。在再灌注期间，由恢复氧供引起的氧化应激反应是引发再灌注损伤的核心环节，而线粒体是其关键[49]。脑缺血再灌注后，兴奋性氨基酸损伤、低氧、钙超载等多种因素作用引起线粒体氧化磷酸化障碍，活性氧类生成增多，清除能力下降，导致活性氧类大量积累引发氧化应激反应，进一步加重了线粒体损伤[50]。近年来，有文献报道了氧化应激及线粒体自噬在维护机体稳态中的作用，其中雷帕霉素灭活介导的线粒体自噬，可通过修复氧化应激诱导的自溶酶体/溶酶体功能障碍延缓线粒体的衰老[51]。此外，活性氧类可通过激活PINK1/Parkin通路诱导线粒体发生自噬，清除受损及多余线粒体以维护线粒体健康[52]。可见，机体氧化应激与线粒体自噬的调节是相互的，其在一定程度上起保护细胞内稳态的作用。

2.3线粒体自噬相关蛋白的表达变化 研究发现，缺血后脑组织线粒体内虽然有一定的内源性修复机制，但并不能逆转持续性损伤[49]。而一些药物，如雷帕霉素[32]、复方脑肽节苷脂[34]等可通过影响线粒体膜电位及线粒体相关蛋白的表达诱导线粒体自噬，提高神经细胞在脑缺血后的存活率，并在一定程度上改善神经功能，对脑缺血再灌注造成的脑组织损伤起保护作用。

2.3.1PINK1和Parkin PINK1/Parkin通路调控的线粒体自噬最为典型。其中，PINK1在脑内高度表达，能作为受损伤线粒体的分子感受器；Parkin主要介导底物泛素化，调节蛋白降解和信号转导等。PINK1和Parkin广泛表达于各组织和器官，尤以脑、心肌、骨骼肌等高耗能器官中含量丰富，可作为线粒体受损时的第一道防线。目前有证据表明，PINK1和Parkin参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。氧糖剥夺/复氧可激活PINK1介导的线粒体自噬，并在其病理生理过程中发挥作用[53]。而PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬可能受多种条件影响，如活性氧类可通过激活PINK1/Parkin通路诱导线粒体发生自噬。除线粒体自噬途径外，Parkin和Pink1还可通过其他几种机制影响线粒体的质量控制[54]，如PINK1和Parkin通过PINK1介导的磷酸化和Parkin介导的蛋白酶体降解线粒体衔接蛋白(Miro)影响线粒体运动，从而促进线粒体自噬去除受损的线粒体[55]。此外，Parkin通过蛋白酶体降解锌指蛋白正向调节线粒体生物发生，抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α的转录[56]。以上研究表明，Parkin以不同方式参与线粒体质量控制和代谢的调控。

2.3.2BNIP3和Nix 脑缺血再灌注损伤的首发事件，是脑血流中断造成的脑组织缺血缺氧。BNIP3是低氧诱导因子1的靶基因，其启动子序列中含有低氧反应元件，低氧时能被低氧诱导因子1转录激活，促进BNIP3表达上调。同样，Nix启动子中也含有低氧反应元件，其可被低氧诱导因子1转录激活。在体外和体内研究中，有学者通过模拟脑缺血再灌注模型发现，低氧诱导因子1α不仅可抑制脑细胞凋亡，还能增加细胞自噬，提示低氧诱导因子1α可能通过BNIP3和Nix途径改善脑缺血再灌注后的脑损伤，并可能对脑缺血再灌注后的脑功能持续产生有益作用[57]。但也有研究发现，BNIP3与微管相关蛋白1轻链3相互作用所致的过度线粒体自噬可引发迟发性神经元死亡，且Nix主要调节生理条件下基线水平的线粒体自噬，而BNIP3仅激活过度的线粒体自噬导致细胞死亡[36]。此外，BNIP3可独立调节线粒体诱导和细胞死亡诱导的活性；为激活线粒体自噬，BNIP3作为系链发挥作用，将位于受损线粒体上的BNIP3连接到新生自噬体上存在的微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ[58]。同时，BNIP3还可以增加线粒体发动蛋白相关蛋白1的定位，从而刺激线粒体网络的碎裂，促进受损线粒体的吞噬[59]。

2.3.3FUN14结构域包含蛋白1 据报道，含有FUN14结构域包含蛋白1的FUN14结构域在线粒体自噬中发挥重要作用，特别是在缺氧条件下[60]，但不限于缺氧条件[61]。FUN14结构域包含蛋白1含有与微管相关蛋白1轻链相互作用的经典区域，可直接与微管相关蛋白1轻链或自噬相关蛋白8结合，诱导随后的线粒体自噬。而敲除FUN14结构域包含蛋白1基序可抑制线粒体自噬。此外，FUN14结构域包含蛋白1还通过与Drp1和视神经萎缩蛋白1[62]或钙联蛋白和Drp1的相互作用参与线粒体动力学调控[63]。

2.3.4线粒体融合分裂相关蛋白 缺血性脑卒中急性期的治疗目标是挽救缺血性半暗带，缩小缺血梗死灶的范围并改善神经功能。有研究发现，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，脑组织线粒体分裂和融合相关蛋白Drp1及视神经萎缩蛋白1的表达水平出现失衡[64-66]。过度的线粒体分裂可导致线粒体断裂是线粒体自噬过程中导致细胞死亡的关键步骤。已有研究证明，短暂的全脑缺血会诱导大鼠海马CA1区Drp1的短暂增加[23]。而关于Drp1在脑缺血再灌注损伤中的作用说法不一，有研究发现线粒体分裂抑制剂Mdivi-1的干扰可以加重原代皮层神经元氧糖剥夺/复氧损伤，其机制可能与它抑制Drp1向线粒体的迁移有关，通过抑制Drp1介导的线粒体分裂，来抑制自噬和线粒体自噬的发生，从而加重缺血再灌注损伤[67]。另有研究发现，一些药物(塞络通胶囊、肌肽等)在脑缺血损伤早期可能通过抑制缺血再灌注后Drp1的升高，来抑制线粒体分裂异常，进而恢复线粒体的形态，维持其正常功能，从而减轻脑缺血再灌注损伤[32,68]。

2.3.5Beclin1 Beclin1是自噬的调节蛋白，且也参与了线粒体自噬。研究发现，脑缺血再灌注损伤后，Beclin1在大脑不同部位的表达水平随缺血进程的发展出现升高或降低的复杂变化[69]。此外有研究表明，Beclin1不仅能在BNIP3/Nix介导的线粒体自噬通路中发挥作用，还可与PINK1相互作用，在线粒体自噬中发挥作用[70]。因此，脑缺血再灌注损伤中Beclin1水平的上调或许可以激活线粒体自噬。

3 小 结

脑卒中的发病率、病死率逐年升高，以及对社会和患者家庭的压力，使其防治进一步得到重视。线粒体自噬通过选择性清除线粒体，对细胞内环境的稳定及应激环境中细胞的存活均具有重要意义。很多研究显示，可以靶向线粒体自噬来克服多种疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、心力衰竭等[71-73]。但线粒体自噬的特殊选择性，使其应用于临床变得异常困难。未来，应深入研究线粒体自噬以助于更好地解析脑缺血再灌注病理过程，从而为靶向治疗缺血性脑卒中提供新思路。