环状RNA在糖尿病中的研究进展

刘婷婷，张海东，王 静，谢俊豪，金百翰，黄 勤※

(1.海军军医大学长海医院内分泌科，上海 200433； 2.解放军72506部队卫生队，河南 驻马店 463200)

环状RNA(circular RNA,circRNA)是长链非编码RNA家族的新成员，已成为近年来RNA领域的研究热点。1976年，circRNA首次在植物类病毒中被发现[1]。最初研究者误认为circRNA是线性RNA异常剪接的副产品[2]。随着RNA测序技术的发展，circRNA被证实在不同的物种和不同的细胞系中存在，并发挥着重要的生物学作用。2012年，Salzman等[3]基于高通量测序技术报道了80余个circRNA，随后科学家陆续发现了大量circRNA。有研究证实circRNA参与心血管、神经系统、内分泌系统和肿瘤等多种疾病的发生和发展[4]。由于表达广泛和疾病调控作用，circRNA被认为是多种疾病的生物学标志物和潜在治疗靶点。虽然circRNA相关研究日益增多，但其与糖尿病相关方面的研究较少。现结合国内外相关研究，对circRNA与糖尿病关系的研究进展进行综述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的形成机制与分类 与线性RNA的标准剪切模式不同，circRNA是通过非经典剪接方式进行反向剪接而成，形成机制主要分为外显子环化和内含子环化。外显子环化存在两种模型[5]：模型一为套索驱动环化即在前体信使RNA(pre-messenger RNA，pre-mRNA)转录过程中发生外显子跳跃，进而形成套索结构，后者再通过自身剪接并切除内含子序列，最终形成一个circRNA；模型二为内含子配对驱动环化，是指在pre-mRNA中两个相邻的内含子通过碱基反向互补配对而形成套索结构后切除剩余内含子，从而形成circRNA。Zhang等[6]认为内含子环化亦可作为circRNA的形成机制，即5′端剪接位点富含7个鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)核苷酸序列与3′端分支位点富含11个胞嘧啶(C)核苷酸序列共同构成核心保守序列，该序列可避免circRNA内含子套索结构被去分支酶降解，从而形成完整的 circRNA。此外，多种RNA结合蛋白均会影响 circRNA 的形成，如盲肌蛋白(muscle blind protein,MBL)和Quaking蛋白可促进circRNA形成，而作用于RNA的腺苷脱氨酶1则会对circRNA的形成产生抑制作用[7-8]。

由于circRNA可在基因组的任何区域形成，故可依据来源主要分为以下3类：①外显子来源的circRNA，由外显子序列组成，形成于外显子编码区，主要存在于细胞质[9]；②内含子来源的circRNA，由内含子序列组成，通常源于pre-mRNA剪切，主要存在于细胞核[6]；③外显子-内含子共同来源的circRNA，由外显子和内含子序列共同组成，即在circRNA的形成过程中环化外显子之间滞留有未被切除的内含子，主要存在于细胞核[10]。

1.2 circRNA的生物学特征及功能

1.2.1 circRNA的生物学特征 随着circRNA研究的逐步深入，目前报道其主要具有以下几方面生物学特征。①分布广泛且种类丰富：circRNA广泛存在于多种真核生物且种类丰富。在人、鼠、酵母菌等多种真核细胞中已发现有10万种以上circRNA[11-12]，且某些circRNA的表达水平甚至可达到同一基因来源的线性异构体10倍以上。②性质稳定且半衰期长：circRNA的结构呈首尾相接的封闭环状，且不具备游离的5′端和3′端，使其不易被核酸外切酶RNase R和分支酶降解，故具有更稳定的生物学特性[6]。研究发现大部分circRNA的半衰期均大于48 h，远大于线性mRNA 10 h左右的半衰期[13]。③高度保守性：大多数物种具有高度保守性的circRNA序列。Werfel等[14]在研究人类、大鼠和小鼠的心肌细胞中发现，其具有高度保守性的circRNA 序列含量可达10%左右。④时空特异性：circRNA在不同的组织器官或同一组织器官的不同发育时期，其种类和表达量具有显著差异，即circRNA在生物发展过程中常表现为组织特异性和发育阶段特异性。Salzman等[15]研究发现在乳腺癌细胞系MCF-7中观察到胞质分裂贡献者1基因可高表达circRNA，而在肺癌细胞系A549中则呈低表达甚至无表达。同样，Pan和Xiong[16]发现在线虫的卵母细胞有circRNA存在，而在其早期的胚胎细胞中未发现。

1.2.2 circRNA的生物学功能 circRNA的功能主要包括circRNA的海绵样吸附作用、调控基因转录作用、与RNA结合蛋白相互作用以及参与翻译生成蛋白质4个方面。

1.2.2.1 circRNA的海绵样吸附作用 微RNA(microRNA,miRNA)是一类具有调控作用的非编码RNA，可通过碱基互补配对的方式遏止靶基因mRNA翻译或促进靶基因mRNA降解，参与调控机体的发育过程。circRNA含有miRNA结合位点，可作为竞争性内源RNA，类似“海绵”高效吸附相应的miRNA，从而减少miRNA对其靶基因mRNA的抑制，促进靶基因的表达。小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as),又被称为miR-7的circRNA海绵包含了至少70个miR-7的结合位点。在人和小鼠脑组织中，CDR1as高表达时可通过竞争性结合吸附miR-7进行负向调控，间接导致miR-7靶基因的表达水平提高；反之，CDR1as低表达时则会导致miR-7靶基因表达水平降低[11]。与CDR1as不同，研究者发现来自同源域相互作用蛋白激酶3(Homo sapiens homeodomain interacting protein kinase 3，HIPK3)基因外显子2的circHIPK3可作为多种miRNA的“海绵”[17]。虽然很多研究证实了海绵效应，但也有研究发现大多数circRNA不起miRNA海绵作用[18]。

1.2.2.2 调控基因的转录作用 circRNA可通过顺式调控作用影响相关基因的转录。ciRNA通过结合RNA聚合酶Ⅱ复合体，正向调节该酶的转录活性，从而促进其亲本基因表达[6]。外显子-内含子共同来源的circRNA可与U1小核核糖核蛋白结合形成外显子-内含子共同来源的circRNA-U1小核核糖核蛋白复合体，该复合体通过结合RNA聚合酶Ⅱ从而发挥顺式调控作用促进其基因转录[19]。研究发现circRNA也可作为反转录的转座子介导产生假基因，调控基因表达[20]。

1.2.2.3 与RNA结合蛋白相互作用 circRNA还可通过与多种RNA结合蛋白结合，形成RNA蛋白复合物，进而发挥其生物学作用。如circ-Foxo3能通过结合人DNA结合蛋白抑制剂1、抗应激蛋白局部黏着斑激酶及人低氧诱导因子1α等多种蛋白，抑制其抗衰老和抗应激作用，从而导致细胞衰老[21]。circ-Foxo3还能与细胞周期蛋白依赖性激酶2和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p21)相互作用，形成circ-Foxo3-细胞周期蛋白依赖性激酶2-p21三元复合物，抑制细胞周期进程[22]。Ashwal-Fluss等[23]研究发现MBL可环化形成circMBL，后者可通过其内含子的MBL结合位点与MBL相互作用，抑制生成MBL mRNA而降低MBL蛋白水平。

1.2.2.4 参与翻译生成蛋白质 传统观点认为circRNA是非编码RNA。但近年来有大量报道显示circRNA也具有翻译生成蛋白质的功能[24-26]。Chen和 Sarnow[24]研究发现circRNA含有内部核糖体进入位点时，真核细胞核糖体就能启动翻译。如丁型肝炎病毒的单链circRNA能够翻译出与病毒相关的蛋白，且与肝炎的发生、发展密切相关[25]。此外，circRNA还通过滚环扩增的机制翻译蛋白且增加其表达水平[26]。

2 circRNA与胰岛β细胞

胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)发病的重要机制之一。研究发现miR-7可在胰岛β细胞中过表达，并且通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路损伤胰岛β细胞的去分化功能，抑制胰岛β细胞增殖，减少胰岛素的分泌，从而诱发糖尿病[27]。Hansen等[11]认为CDR1as过表达时可通过海绵样吸附miR-7而负向调控miR-7，阻碍miR-7对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的抑制作用，刺激胰岛β细胞增殖，使胰岛素分泌水平增加。Xu等[28]利用毛喉素和佛波酯长期刺激胰岛β细胞使CDR1as含量增加，抑制miR-7活性并上调miR-7的靶基因Pax6和Myrip的表达，而两者可增强胰岛素基因转录并调节胰岛素颗粒运输，促使胰岛素分泌水平增加，提示CDR1as/miR-7可能成为治疗糖尿病的新靶点。Stoll等[29]运用微阵列方法检测糖尿病模型小鼠的胰岛β细胞中circRNA的表达水平及其作用机制，结果显示circHIPK3在小鼠的胰岛中表达下调，并导致β细胞扩增减少和胰岛素分泌降低，其机制可能与circHIPK3通过竞争性结合miR-338-3p和miR-124-3p以及调控β细胞关键基因(葡萄糖转运体2、肌侵蛋白和蛋白激酶B1)的表达有关，而上述这些miRNA可能在胰岛β细胞发育、增殖和功能中发挥重要作用。由此表明，circHIPK3可能是调节胰岛β细胞功能活性的新分子。Kaur等[30]发现β细胞中显著上调的circRNA包括转化生长因子-βⅢ型受体和组蛋白去乙酰化酶9，其中转化生长因子-βⅢ型受体因子参与编码转化生长因子-βⅢ型受体，而转化生长因子-β信号转导可诱导人胰岛和成年小鼠的β细胞复制，提示circRNA在调节胰岛β细胞的功能中起重要作用。

3 circRNA与糖尿病的相关研究进展

我国糖尿病患者约有4 000万，其中T2DM约占90%[31-32]。T2DM是由于胰岛素分泌绝对或相对不足，或者靶细胞对胰岛素敏感性降低，造成糖代谢紊乱的一种慢性综合性疾病，其晚期发生并发症的概率较高，极易出现心脑血管病变、视网膜病变、末梢神经炎及糖尿病肾病等多种疾病。circRNA在糖尿病并发症的发生、发展过程中有重要作用，可能作为糖尿病诊断与治疗的潜在生物标志物。

3.1 circRNA与糖尿病并发症的关系

3.1.1 circRNA与糖尿病心脑血管病变 糖尿病患者常伴有高血压、血脂紊乱等心脑血管病变的重要危险因素，与非糖尿病人群相比，糖尿病患者发生心脑血管疾病的风险明显增加。糖尿病合并心脑血管病变主要是动脉粥样硬化，如冠状动脉粥样硬化引起心肌梗死、心绞痛、心力衰竭和猝死；脑动脉硬化引起缺血性发作、脑梗死。研究发现circRNA与和T2DM患者的冠状动脉疾病的发生具有最强的相关性，研究人员将研究对象分为T2DM患者、冠心病患者、T2DM合并冠心病患者3个试验组和健康人群对照组，通过微阵列分析鉴定各组差异表达的40个 circRNA，其中试验组中13个circRNA表达上调，而27个circRNA表达下调，进一步筛选出显著下调的Hsa_circ_11783-2并利用实时荧光定量聚合酶链反应进行验证，结果显示Hsa_circ_11783-2与T2DM患者冠状动脉疾病的发生关系密切[33]。Zhou和Yu[34]报道circRNA_010567在糖尿病小鼠心肌中表达显著上调，进一步研究表明circ RNA_010567/miR-141/转化生长因子-β1通路在糖尿病小鼠心肌纤维化的过程中起重要调节作用。此外，Tang等[35]发现糖尿病小鼠心肌中表达上调的circRNA_000203，通过海绵吸附miR-26b-5p抑制其抗纤维化作用。

3.1.2 circRNA与糖尿病微血管病变

3.1.2.1 circRNA与糖尿病视网膜病变 微血管病变是糖尿病的特异性并发症，可累及全身各组织器官，其中以糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病尤为重要。目前有关circRNA与糖尿病微血管病变的研究集中在糖尿病视网膜病变。Zhang等[36]研究证实Hsa_circ_0005015在糖尿病视网膜病变患者的血浆、玻璃体标本和视网膜内皮血管膜中的表达明显上调，并通过吸附miR-519d-3p抑制其功能，从而上调相关靶基因基质金属蛋白酶-2、细胞X连锁凋亡抑制蛋白和转录活化子3的表达。Shan等[37]研究发现糖尿病视网膜和视网膜内皮细胞中circHIPK3显著上调，其机制可能是circHIPK3抑制miR-30a-3p活性，调节下游基因血管内皮生长因子C、卷曲蛋白4 和WNT2来影响糖尿病性视网膜病变，故认为抑制circHIPK3可能减少视网膜毛细血管渗漏和炎症，改善视网膜血管功能障碍，表明circHIPK3是减轻糖尿病相关视网膜病变的潜在治疗靶点。此外，研究人员首次揭示了高糖诱导的血管平滑肌细胞的表达谱，并发现circWDR77/miR-124-成纤维细胞生长因子2 调节通路在血管平滑肌细胞增殖和迁移中起作用，为糖尿病微血管病变提供了新的理论依据[38]。

3.1.2.2 circRNA与糖尿病肾病 我国20%～40%的糖尿病患者合并糖尿病肾病，现已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因[39]。Hu等[40]发现circRNA_15698/miR-185/转化生长因子-β通路促进细胞外基质相关的蛋白质合成，为糖尿病肾病的发病机制提供了新思路。但circRNA与糖尿病肾病方面相关报道较少，需要进一步深入研究。

3.1.3 circRNA与糖尿病周围神经病变 糖尿病周围神经病变是最常见的糖尿病并发症之一，临床常表现为神经性疼痛，显著降低了患者的生活质量。Wang等[41]研究发现circHIPK3在链脲菌素诱导的糖尿病大鼠血清和背根神经节中含量较高，并通过敲除糖尿病大鼠circHIPK3后发现白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12和肿瘤坏死因子-α的表达降低，大鼠神经性疼痛明显缓解。进一步研究表明其机制可能是circHIPK3通过负向调节miR-124的表达发挥作用。研究人员通过鞘内注射circHIPK3 shRNA缓解糖尿病大鼠的神经性疼痛，并证明了该方法可能成为治疗糖尿病神经性疼痛的手段之一。

3.2 circRNA与糖尿病的诊断的关系 研究表明，circRNA可作为潜在的生物学标志物，诊断和预测肿瘤、心血管疾病、内分泌代谢疾病和中枢神经系统等疾病[4]。Zhao等[42]通过微阵列技术分析对比健康人群和T2DM患者外周血中的circRNA水平，结果显示两组共有489个circRNA的表达存在差异，其中T2DM组有78个circRNA表达上调，411个circRNA表达下调，然后筛选出5个circRNA作为候选生物标志物进行验证发现Hsa_circ_0054633具有作为前驱糖尿病和T2DM的诊断生物标志物的潜力。Fang等[43]研究发现circANKRD36在T2DM患者的外周血白细胞中高表达，推测其可能通过与miRNA(包括Hsa-miR-3614-3p、Hsa-miR-498和Hsa-miR-501-5p)相互作用参与T2DM的慢性炎症相关途径，提示circANKRD36可用于判断T2DM患者是否存在潜在感染的生物标志物。

4 小 结

近年来circRNA是非编码RNA家族的研究热点之一，其多种生物学功能正逐渐被人们所认知。尽管越来越多的研究认识到circrRNA在糖尿病的发生、发展中起关键的调节作用，但目前对circRNA与胰岛β细胞和糖尿病的研究仍处于探索阶段，其更深层次的生物功能及分子机制有待进一步揭示。相信随着RNA高通量技术和分子生物学技术的不断发展，对circRNA与糖尿病及并发症发生、发展的关系将会有更加透彻的认识。circRNA也极有可能成为糖尿病诊断和预测的潜在生物标志物之一，有助于糖尿病的诊断、预后和精准治疗。