牙周炎动物模型的研究进展

孔 晨，李永丽，李思佳，孙慧颖，任纪巍，王 雷

(吉林大学口腔医院牙周科， 长春 130021)

牙周炎是一种常见的牙齿周围组织即牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质破坏的慢性感染性疾病，目前普遍认为菌斑微生物及其产物在局部的堆积和浸润是牙周炎发生、发展的关键因子，而机体对此的应答反应则是决定牙周炎发生与否、发病速度、病变程度以及范围的重要因素[1]。研究表明，牙周炎不仅导致牙龈出血、牙槽骨吸收、牙齿松动和脱落、牙周袋形成等局部病理变化，也与一些全身性疾病，如糖尿病、类风湿关节炎、心血管疾病、不良妊娠等密切相关[2]。近年来，随着医学知识的普及和人们对口腔健康重视程度的加深，牙周炎作为一项发病率极高且影响广泛的口腔疾病，其防治工作迫在眉睫。建立正确合理的动物模型，有利于深入研究影响牙周炎发生发展的关键因素，为疾病的控制、药物研发提供思路，从而开展积极有效的临床防治工作。现就实验动物的选择、建模方法与机制，以及实验中常见的影响因素予以综述。

1 动物选择

1.1灵长类 灵长类动物的口腔结构与人相似，其中猴与人的牙式相同，除尖牙较大，剩余牙齿的形态均与人牙相近，牙根形态及分叉情况也与人基本一致，因此建立的牙周炎模型与人相似度最高。灵长类动物具有天然存在的牙菌斑、牙结石和口腔微生物病原体，牙周炎易感性高，一般在选定臼齿周围的邻间区域的顶端放置牙菌斑积聚装置如正畸弹性结扎丝，以促进斑块形成、加速炎症进程[3]。使用恒河猴建立牙周炎模型应用的最为广泛，食蟹猴、猕猴、狒狒也有较多采用，但因属于自然保护动物，购买途径少且繁殖较慢，易感染结核，在大规模实验研究中的应用受到较大的限制[4]。

1.2犬 犬的牙周组织结构以及牙周炎的病理学特点均与人相似，牙面常有牙石沉积，龈下菌斑的构成也与人类相似，其为研究自然发生的牙龈炎和牙周炎提供了合适的模型。Beagle犬作为牙周炎动物模型的造模动物被外国学者广泛采用，1965年Egelberg[5]通过在Beagle犬牙颈部龈缘结扎并辅以牙周炎食谱成功建立了实验性牙周炎模型。一般选择全身发育良好，年龄1岁左右，体重12～15 kg的犬建立牙周炎模型。犬的患病率和病变程度随年龄的增长而增加，不同品种之间差异明显，这种在易感性和耐受性方面的差异来源于感染的性质和遗传因素而非饮食[6]。另一方面，犬的攻击性强、不易饲养、牙周病变程度和部位不均匀等特点也造成了该模型应用的局限性[7]。

1.3大鼠 大鼠每个象限有1个门齿和3个臼齿，一般通过在臼齿周围的龈沟中放置结扎线或接种牙周病原体引起牙周病[8]。牙周炎模型构建时多采用2～4月龄的SD大鼠和Wistar大鼠，后者性情更为温顺。因大鼠繁殖率较高，饲养成本较低，因此有足够的数量进行研究和统计分析，又因其生命周期短，适应能力及抗病能力强，可快速诱发疾病，是目前应用最广泛的动物，尤其适用于测试各种药剂缓解炎症的功效[9]。但大鼠牙周病发病率远低于人，且牙齿小，对操作和观察有一定影响，同时因大鼠的牙齿能持续不断的生长，只适合短时程的实验研究。

1.4兔 兔口腔内存在多种病原微生物，菌群分布与致人牙周病的菌群相似，可较准确地模拟人类口腔疾病状态[10]。除在牙齿周围进行可重复的牙周炎症研究外，兔的主要优点是单独结扎不会引起软组织或硬组织破坏。因此，与大鼠和小鼠相比，其可用于测试人类牙周病病原体的特定影响。结扎放置通过将共生菌群转化为口腔致病菌群而诱导牙周病。目前兔较少用于构建牙周炎模型，主要用于测试生物材料或治疗种植体周围炎，兔也是测试骨愈合及其他非牙齿炎症如心血管疾病的适用模型[11]。

1.5小型猪 自20世纪50年代以来，各种微型猪已广泛用于生物医学研究、人工器官研究以及作为皮肤伤口愈合模型。由于猪在大体解剖学和生理学上与人类相似，一些小型猪可通过类似的过程罹患人类疾病如糖尿病，与其他大型物种相比具有经济优势，是全身性疾病的优秀模型[12]。小型猪与人一样有乳牙和恒牙，牙齿大小、牙周组织都与人相近。研究表明，6个月后的小型猪经常自发不同程度的牙龈炎，疾病进展模式与人类相同:牙龈肿胀，菌斑积聚，牙结石形成以及探诊出血，并在组织学上伴有炎症细胞浸润和血管舒张，16个月时即可能发展为严重的牙周炎症[13]。虽然目前因为价格、饲养问题而应用较少，但其有望成为自发性牙周炎的理想实验模型。

1.6其他动物 小鼠和大鼠同属于啮齿动物，每个象限中有3个臼齿和1个无根切牙。由于小鼠牙齿细小，且每只只能提供微量的牙龈组织，因此实验时需要扩大样本量。年轻小鼠如果存在吞噬细胞遗传缺陷，其控制原生菌的能力会受到影响，可能会发生由自身微生物群引起的牙周炎，是研究口腔病原微生物对牙周组织影响及宿主反应的优势模型[14]。仓鼠的牙齿也与大鼠类似，牙周炎无自发性，颊囊内衬有复层鳞状上皮，可用于口腔癌的研究[15]。羊具有自发性牙周炎的临床特征和血清学特点，口腔微生物情况与人牙周炎极相似，但因其空间需求大、成本高、难控制，一般较少使用。雪貂会自然发生与人类相似的牙结石和牙周病，是研究牙结石的适宜模型，但其易从标准笼中脱出，需要特殊管理。

综上，建立动物牙周炎模型时，大鼠、犬、小型猪以及猴的使用率最高，所选用的动物各有优缺点，其中大鼠以价格低廉、操作简单、易于饲养、成活率高等优点而应用的最为广泛。动物模型的构建基础是选择合适的实验动物，所选动物应具备形体适宜、饲养方便等基本要求，并能较好地模拟人类牙周病的变化过程。

2 建模方法

2.1结扎线法 结扎线法诱导大鼠牙周骨丢失首次描述于1966年，目前单纯利用该法构建动物牙周炎模型的技术已相当成熟，在各种牙周病的研究中均得到广泛使用。常用的实验动物是大鼠和小鼠，结扎材料有尼龙线、细丝线、橡皮圈、正畸用钢丝等，一般结扎在实验动物的牙颈部或龈沟内，主要通过结扎部位牙石和菌斑的积累刺激炎症产生。此外，结扎时需要对牙颈部的牙龈组织进行轻度剥离，从而对牙龈牙周组织造成机械损伤，进一步导致牙周结缔组织破坏和牙槽骨丢失，从而实现动物牙周炎模型的建立。

唐彩金等[16]采用10%的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射对SD大鼠进行麻醉，然后用尖头探针将第二磨牙的牙龈分离，用缝线在龈沟内结扎，15 d后进行组织学观察，确定建模成功。崔迪等[17]用同样的方法对9周龄的C57BL/6雄性小鼠的上颌第二磨牙进行结扎，28 d后牙槽骨吸收明显。近年来大量研究显示，采用单纯结扎法通常在1～4周内实验牙即出现明显的牙龈红肿、牙周袋形成、探诊出血、菌斑堆积和牙槽骨吸收现象，且腭侧结扎引起的骨丢失较颊侧更为可靠[18-21]。此法不仅适用于大鼠，也基本适用于猴，但其建模周期更长。Kstopoulos和Karring[22]利用正畸用弹性橡皮圈结扎猴的上颌第一前磨牙、第一磨牙以及下颌侧切牙的牙颈部，2～3个月后才有明显的牙周组织破坏及牙槽骨丧失。目前，结扎线法因操作简单、耗时较短而被广泛采用，其中以正畸不锈钢丝结扎的效果最好，成功率更高。在建模过程中要定期检查结扎材料是否脱落，或根据需要进行更换。

2.2高糖黏性食料喂饲 调整动物饮食，制定特定的牙周炎食谱也是建立牙周炎模型的一种方法。一方面，黏性软食在牙齿局部的黏附和嵌塞不利于牙的自洁，可加剧菌斑的附着和累积。另一方面，高糖饮食导致的糖尿病等疾病也对牙周炎有影响[23]。高血糖通过削弱牙龈的免疫力，一定程度上降低了牙周组织的抗感染能力，进而引发炎症。高糖黏性食料喂饲最早由国外学者发现并验证。采用高糖低蛋白饲料饲养时，实验动物会有牙周袋产生、牙槽骨吸收和炎性细胞浸润等病理变化，但单独使用此法建模效果一般，且耗时较长。国外学者给予6周龄的雄性金黄地鼠高糖食谱(100 g食物含蔗糖56 g、全脂奶粉28 g、全麦粉6 g、酵母粉4 g、食盐2 g、新鲜蔬菜4 g)，12周后才确定模型成功[24]。Zhu和Nikolajczyk[25]与Sarda等[26]探讨糖尿病与牙周组织病变的联系时，两者的相互作用和影响也得到了证明。现阶段，高糖黏性食料喂饲常与其他手段联合使用，辅助诱导动物牙周炎的形成[27]，或用于伴糖尿病牙周炎动物模型的研究[28]，以更好地模拟临床上相应患者的发病机制。

2.3接种细菌法 不良微生物及其产物的局部累积被普遍认为是牙周炎发生的始动因子，其通过直接破坏以及引发的宿主炎症反应导致大部分组织破坏。牙周炎的发生发展并非传统认为的是特定少数细菌导致的，而是不同细菌之间协同作用以增强对宿主防御的抵抗力、营养物摄取能力以及在炎症环境中存在的持久力[29-30]。造成口腔微生物-宿主生态失衡的至关重要的低丰度细菌如伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等目前被称为关键病原体，如牙龈卟啉单胞菌可以干扰宿主免疫力，并使异常生物群落出现，其也是目前建立动物牙周炎模型使用最为广泛的菌种。一般为评估牙龈卟啉单胞菌在牙周组织中的侵袭性、评估特定牙龈卟啉单胞菌突变体定植以及引起骨丢失的能力多选择灵长类动物、犬和小鼠模型[31]。

通过直接注射、局部涂抹或含菌食物嵌塞将致病菌接种至动物口腔均能诱导实验动物产生牙周炎。研究表明，单一使用伴放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌都能建立小鼠牙周炎模型，且多种因素感染较一种因素感染引起的牙槽骨吸收更为严重[32-34]。也有学者指出，以注射或涂抹的方式接种细菌与牙周病发生的始动过程相悖；在食物中接种致病菌，进而使致病菌停留在口腔，这一过程与自然的病菌感染过程更为相似[35]。研究发现，革兰阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖具有强毒性和抗原性，易引发牙周炎，因此也可直接采用脂多糖诱导动物牙周炎产生[36]。甚至有研究认为，定位注射细菌脂多糖可能是一种更直接和受控制建立牙周病模型的方法，因为该疾病是由已知的牙周病病原体诱导的，感染时间准确，且对病原性刺激有更大的可控性[37-38]。

2.4植入牙石法 在一项针对牙周病患者的长期调查中发现，牙石在引起成人牙周病的因素中排名第2，仅次于菌斑，提示利用牙结石诱发牙周炎症的可能性[39]。牙结石对牙周组织持续刺激，导致炎症反复发作，同时牙结石压迫牙龈，影响血液循环，造成牙周组织病菌感染，引发牙龈炎症及萎缩，形成牙周袋，导致食物残渣、菌斑和牙石等更易堆积，从而形成恶性循环。该方法虽然已在部分实验动物如兔、大鼠中得到了验证，但目前根据该方法建立牙周炎模型的研究少见，可能与其可控性小、病程与人自然发病过程相悖等有关。

2.5注射激素法 有观点认为，糖皮质激素长期高水平导致的糖皮质激素受体过度激活可能会改变免疫系统反应，提高牙周炎的易感性[40]，但目前尚无定论。周秀青等[41]对SD大鼠进行醋酸泼尼松龙肌内注射，用药第3日大鼠即出现食欲下降、倦怠少动等表现，后牙槽骨逐步呈现骨质疏松性改变，验证了肌内注射糖皮质激素构建牙周炎模型的可行性。但也有学者报道，单纯糖皮质激素失调不会引起明显的牙周炎症，只会加重牙周炎的程度[42]。目前这种方法尚不成熟、重复性低，对牙周炎的影响程度和机制还亟待进一步研究，但可用于探究应激时全身激素水平变化对牙周炎的影响。

2.6综合方法构建模型 单一方法构建模型虽然操作简便，但并不能很好地模拟人发病过程中诸多因素的相互作用，与真实情况存在较大差异，实验周期一般较长，可控性也相对差。随着动物牙周炎模型的日趋成熟，越来越多的学者青睐于多种方法联合应用建模，以达到不同的实验目的。一项对比实验证明，两种或两种以上因素的联合刺激有助于缩短实验周期，提高建模效率[43]。常见的方法有结扎线法配合高糖喂养、细菌接种配合高糖喂养、细菌感染合并结扎丝线、黏结牙石加细菌接种等，通常以一种因素的作用为主，其他因素辅助加重和加快牙周炎症进程[44-46]。在此过程中，各种因素不仅相互促进，而且在一定程度上弥补了彼此的局限性。如细菌接种虽然作为始动因素对局部组织的刺激作用很强，但忽略了全身因素的影响，结扎和牙石同样只适于局部直接研究。激素水平和血糖水平的改变能够反映临床上部分患者的发病过程，使实验目的更明确，实验结果更有参考价值。此外也有一些学者采用特殊方法建立模型，如剥离大鼠下颌第一磨牙牙周与牙根面后，每3天缓慢灌注0.2 mL凝胶至龈下，配合高糖饲料喂养，由于凝胶培养基为厌氧菌提供了适宜的生存环境，可以促使厌氧菌快速增殖，与仅剥离牙龈和糖饲料喂养的大鼠相比，该组大鼠炎症发展更快，且可累及全侧甚至对侧牙周组织[47]。此方法刺激胃部，可产生胃火型牙周炎，弥补了该型牙周炎的空白，对中医药的研究有重要意义。

综上，牙周炎动物模型的建立可采用不同方法，若采用某种单一方法进行牙周炎动物模型的构建会导致病变局限，忽略了全身性因素的影响，而多个因素同时运用，有利于建立快速、稳定的牙周炎模型。然而无论哪种模型都无法完全复制人类牙周炎发生和发展的所有方面，如接种细菌时使用的只是存在于任何牙菌斑生物膜中的至少150种微生物类型中的一种或两种；应激时全身激素水平的变化和实验中局部注射激素对牙周炎症的影响也有区别；在选择建模方法时，除考虑可操作性、成功率、建模周期等外，还应注意不同实验目的对实验模型的需求，以及一些常见因素如性别、年龄、麻醉药品对实验的影响等。

3 影响因素

评估检测牙周炎模型时发现，雌性小鼠牙龈炎症介质的表达水平和牙槽骨缺失程度明显高于雄性小鼠[48]。但在实际临床工作中，男性较女性更易患牙周炎，这可能与男性吸烟以及不良口腔卫生习惯致牙结石增多和牙周组织破坏有关。有研究表明，尼古丁会造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，同时抑制牙周组织再生修复，并呈现剂量依赖性[49]。也有学者认为，男性体内的雄激素可以调节颌下蛋白酶的活性，促进菌斑钙化和牙石形成，让男性较女性更易罹患破坏性牙周炎[50]。牙周炎的发病率随着年龄的增长而升高，但目前人们对牙周炎与年龄的相关性了解甚少。近年来也有研究证实了肥胖与牙周炎的关系[51]，因此建模时不能忽略性别、年龄、体重等因素对疾病的影响。由于建立动物牙周炎模型需要反复麻醉，可能导致多种麻醉不良反应，如体重下降、心肺功能抑制、内脏病变等[52]，此外，动物在应激状态下体内激素的水平也会发生变化。

4 结 语

牙周炎的治疗是当前国内外学者研究的热点问题，寻找合理有效的药物至关重要，成功建立符合要求的牙周炎动物模型是实验研究的关键。虽然动物模型提供了大量重要数据，但其研究结果只能提供某种新型药物安全性和潜在功效的初步信息，不能直接将这些结果等同于人类牙周炎的结果[53]。另外，全身因素导致的个体差异很难解释，一些口腔卫生习惯差的群体并未表现出牙周炎症，而某些口腔菌斑较少的人却患上严重的牙周炎。真正能够模拟人类牙周病自然发病机制、实用且重复性高的模型还亟待进一步探索和研发。