含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白1的研究进展

曲光瑾，张铁民，王宇虹，罗善顺，张 婧，韩 辉※

(哈尔滨医科大学附属第一医院 a.老年病科 国家老年疾病临床医学研究中心， b.结直肠外科，哈尔滨 150001)

含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白1(cysteine and histidine rich domains containing protein-1，CHP-1)又称Morgana，是高度保守的蛋白质家族成员之一，对植物发育和抗病性起重要作用。动植物可能具有相似的发育和抗病机制，动物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白结构上类似于植物抗病蛋白(R蛋白)的一个亚类，参与细胞内病原体的识别和炎症反应的启动。脊椎动物具有两个半胱氨酸和组氨酸丰富域(cysteine and histidine rich domains，CHORD)包含蛋白，即CHP-1和Melusin，无脊椎动物仅有CHP-1。Melusin是心肌特异性整合素结合蛋白，参与心肌细胞的过度增长，而CHP-1可在所有组织和细胞中普遍表达。序列分析表明，脊椎动物CHP-1和无脊椎动物CHP-1是同源物，而 Melusin 可能起源于进化过程中的基因复制[1]。哺乳动物CHP-1蛋白与热激蛋白(heat shock protein，HSP)90相互作用。CHP-1和HSP90的分子伴侣p23和S相激酶相关蛋白1的G2等位基因抑制因子(suppressor of the G2 allele of Skp 1，SGT1)有相似的结构序列，可能是HSP90的分子伴侣，广泛存在于哺乳动物的各组织器官，对生物的正常发育起重要作用。CHORDC1基因缺失可导致不育或胚胎死亡。CHP-1蛋白可在细胞缺血应激过程中避免凋亡，起到保护细胞的作用，并与多种疾病的发生、发展密不可分。现就CHP-1的研究进展予以综述。

1 CHP-1的发现

Shirasu等[2]报道了一类新的真核锌结合蛋白，是一种多物种抗病性基因(Rar1基因)编码的蛋白，不仅存在于大麦抗病信号转导中，还是秀丽隐杆线虫发育的必需蛋白，参与细胞内病原体的识别和炎症反应的启动[3]。Rar1基因对过氧化氢刺激的宿主细胞具有保护作用，可降低其死亡率，其编码含有60个氨基酸的蛋白，包括两个分子量为25 500的CHORD蛋白，即CHP-1和Melusin[4]。Melusin是一种与心肌肥厚机械负荷有关的肌肉特异性蛋白，与CHP-1有63%的同源性，广泛分布于机体各种组织细胞[5]。沉默秀丽隐杆线虫的CHORD-containing基因可导致半数秀丽隐杆线虫不育[6]。CHP-1+/-小鼠并不表现发育异常或可见畸形[7]。杂交鼠胚胎形成3.5 d后，形态正常的CHP-1-/-胚胎以正常的孟德尔频率出现，但此后未再检测到CHP-1-/-胚胎，提示CHP-1基因在动物发育过程中起重要作用[8]。

2 CHP-1的结构

CHP-1具有两个CHORD区域，N端由92个氨基酸序列间隔，C端Melusin含有30个酸性氨基酸残基的钙结合伸展结构；而CHP-1的C端由85个氨基酸组成，与SGT1有很大同源性[9]。SGT1是泛素连接机制和酵母动粒组装途径的重要组成部分，也是重要的植物抗病蛋白[10]。对小鼠和人类进行基因组序列分析的研究表明，CHP-1基因定位于小鼠第9号染色体，人类11q14.3染色体[11]。CHP-1和Melusin基因共享保守的外显子和内含子，其基因编码序列在小鼠和人类基因组中由11个编码外显子组成。小鼠和人类基因组的CHP-1编码外显子的分子量均为21.6 kb左右，前4个外显子(1～4)编码第一个CHORD结构域以及中间区域，而第二个CHORD完全由3个外显子(6～8)编码，SGT1样结构域由3个末端编码外显子(9～11)编码[11]。数据库分析并验证其他种属CHP-1和Melusin同源性发现，真菌和斑马鱼CHORDC基因可编码Melusin和CHP-1，但在果蝇和秀丽隐杆线虫中只能编码CHP-1，且果蝇和秀丽隐杆线虫特有的CHORD蛋白与小鼠和人类CHP-1的同源性高于Melusin[12-13]。CHP-1是金属结合蛋白，可以结合植物CHORD区域的锌离子，并保留了调节哺乳动物CHORD区域锌离子的能力。由于CHP-1不具有末端酸性结合域，因此不结合钙离子[14]。

3 CHP-1的作用及机制

CHP-1是与系统发育相关的保守蛋白质，通过抑制ROCK激酶的活性调节中心体复制，广泛存在于成体有丝分裂后的组织，除细胞分裂调节作用外，还对细胞应激起保护作用。CHP-1分子伴侣活性可能保护细胞应激损伤[15]。CHP-1的表达与HSP70类似，免疫印迹分析显示，以43 ℃孵育NIH 3T3细胞 45 min，然后复温至37 ℃，复温后维持3 h，CHP-1信使RNA的转录增加3倍，同时蛋白水平升高；热应激后8 h，转录水平回落至基线。NIH 3T3细胞转染过表达CHP-1慢病毒，升温或过氧化氢处理后，可避免细胞的致死性应激[16]。

短暂性脑缺血发作可使受损蛋白和多种HSP增加。缺血期3～5 d，海马1区神经元的坏死显著增加，海马2～4区和齿状回区神经元的坏死较少，表明后者具有内在保护机制。对沙鼠海马1区、海马2～4和齿状回区CHP-1的表达水平进行测量发现，缺血3 h后，两个部位CHP-1表达上升程度相似；缺血24 h后海马1区CHP-1信使RNA表达水平恢复至基线，海马2～4和齿状回区的CHP-1信使RNA表达始终升高；且海马缺血再灌注区HSP70的上调时间也较长，与CHP-1水平一致[17]。

CHP-1能够结合和抑制ROCKⅠ和ROCKⅡ激酶的活性[18]。ROCKⅠ激酶在细胞凋亡中具有特异性作用，活性ROCKⅠ激酶过表达可诱导细胞膜起泡，细胞皱缩和核裂解，从而发生细胞凋亡。ROCKⅠ激酶还参与诱导上游的胱天蛋白酶3激活诱导的细胞凋亡，活性ROCKⅠ激酶突变体的表达足以诱导新生大鼠心肌细胞胱天蛋白酶3的裂解和激活。此外，ROCKⅠ激酶可磷酸化造血细胞和心肌细胞的第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)229和Thr321，提高PTEN的稳定性和活性。CHP-1可抑制ROCKⅠ激酶的活性，并高表达CHP-1，导致NIH 3T3细胞和乳腺癌细胞系的PTEN水平降低。CHP-1调节PTEN的能力取决于ROCKⅠ激酶，活性ROCKⅠ激酶可使PTEN的水平恢复正常，并增加过表达CHP-1细胞凋亡刺激的敏感性。PTEN是一种有效的肿瘤抑制剂，其缺失导致细胞自噬信号通路激活，PTEN的轻度下调对肿瘤的易感性和进展有强烈的影响，并可影响细胞存活和化疗的耐药性。三阴性乳腺癌PTEN呈低表达，故PTEN缺失可用于预测三阴性乳腺癌的早期复发。PTEN的表达和功能受不同机制(如基因突变、表观遗传沉默、微RNA调节、竞争性内源RNA、翻译后修饰和定位改变癌细胞)的调节，通过翻译后修饰破坏PTEN。CHP-1表达水平的增加可抑制ROCKⅠ激酶，导致PTEN不稳定，并提高化疗药物的耐药性。与原发性肿瘤相比，卵巢癌化疗后复发CHP-1的转录水平上调[19-20]。

CHP-1通过抑制ROCKⅡ激酶在中心体复制和基因组稳定性中起关键调控作用。中心体是大多数动物细胞的主要微管组织中心，包括一对中心粒，由中心粒外周物质包围，形成组织微管，有助于细胞两极形成纺锤体。正常细胞的中心体复制被严格调控，每个细胞周期仅发生一次。当调节机制失调时，同一细胞周期内中心体发生多次复制，导致具有多余中心体的细胞出现，此现象称为中心体扩增[21]。具有多余中心体的细胞可形成异常纺锤体，无法介导染色体分离，导致出现非整倍体和多倍体细胞，促进肿瘤进展。CHP-1基因高度保守，在系统发育过程中起重要作用。果蝇神经母细胞中CHP-1的缺失导致强烈的有丝分裂表型，多倍体细胞频繁出现，大多数二倍体细胞出现中心体扩增。CHP-1+/-胚胎来源的小鼠胚胎成纤维细胞的CHP-1单倍体缺陷，导致多倍体细胞、多中心体和多极纺锤体的高发。基因组不稳定性是癌细胞的典型特征，有利于癌症的发生发展。与野生型小鼠相比，CHP-1+/-小鼠对化学诱变剂的敏感性显著升高[4]。

4 CHP-1与HSP90的相互作用

对伴侣HSP90结构的研究表明，核苷酸和药物配体可诱导几种不同的构象状态，但具体机制尚不清楚[22]。与其他HSP90共伴侣相似，CHP-1对热变性柠檬酸合成酶具有自身的伴侣活性，此活性存在于CHP-1和SGT1的相似结构序列中。SGT1结构域与小型HSP的α-结晶结构域同源，可控制变性蛋白的聚集和分解。采用串联质谱方法研究ATP、ADP和凝胶霉素对人HSP90相互作用体蛋白质组影响的研究发现了52种HSP90复合物的调节配体和分子伴侣；格尔德霉素处理后导致HSP90复合物显著富集于CHP-1核心转录区，提示HSP90抑制可能在转录和CHP-1 RNA处理上具有共同的基础作用，进一步证实了CHP-1是新的ADP依赖的HSP90相互作用蛋白；这种相互作用是由细胞裂解液中高AD∶ATP 比值以及体外纯化的重组蛋白刺激和HSP90结合核苷酸的能力决定[23]。

HSP90相互作用体在核苷酸和药物配体方面是动态的，且HSP90的药理抑制可能刺激特异性复合物的形成。二聚体HSP90 ATP酶是一种高效的分子伴侣，在蛋白质折叠途径的后期发挥作用，以协助折叠和激活特定蛋白质。HSP90在细胞分裂、代谢、信号转导、转录和免疫等多种生物过程中发挥重要作用，是重要的抗癌靶点。HSP90复合物含有几种分子伴侣和辅助蛋白，可调节ATP酶活性和辅助蛋白间相互作用[24]。在肾上腺皮质细胞系HEK293T中稳定表达N端及C端异常糖链糖蛋白标记的HSP90互补DNA，在5 mmol/L ATP、5 mmol/L ADP或5 mol/L格尔德霉素存在下对HSP90复合物进行异常糖链糖蛋白标记。HSP90复合物不能水解ATP，但能结合核苷酸的E47A突变体，其亲和力与野生型HSP90蛋白相当。异常糖链糖蛋白标记突变体在体外可增强HSP90与底物肽之间的相互作用。有研究证明，酵母中与CHP-1类似的突变可加强酵母p23同源物Sba1p和酵母HSP90之间的相互作用，此相互作用受ATP的积极影响[25]。HSP90抑制剂治疗后，HSP70表达显著上调，由于参与应激反应的CHP-1亦在格尔德霉素依赖复合物中被鉴定出，故认为CHP-1可能同样上调[26]。使用反转录聚合酶链反应确定依赖于格尔德霉素交互作用亚群的研究发现，经格尔德霉素处理后，HSP90复合物中蛋白质的增加与细胞丰度增加无关[27]。若HSP90和HSP70结合的相互作用发生在格尔德霉素处理后，则HSP70信使RNA表达的增加将直接反映在肽谱计数中。经格尔德霉素处理后，HSP70同源物HSPA8和HSPA1A的信使RNA丰度分别上调了2倍和18倍，而相应蛋白质光谱丰度的差异无统计学意义[28]。通过D93N可确定HSP90复合物依赖活性HSP90 ATP酶或HSP90结合核苷酸或凝胶霉素的能力。D93N突变阻止了HSP90 ATP酶活性位点的核苷酸结合，并基于D93N的类似机制与格尔德霉素和腺嘌呤核苷酸的接触预测D93N突变对明胶霉素结合的干扰。可见，CHP-1依赖格尔德霉素与HSP90复合物成员的相互作用将显著受损。

5 CHP-1在临床中的应用

CHP-1减少可使细胞发生癌变，增强肿瘤易感性。在乳腺癌和肺癌中，CHP-1表达降低[乳腺癌67.3%(37/55)，肺癌57.7%(45/78)]，但可在少数乳腺癌(5.4%)和肺癌(10.3%)中过表达，特别是三阴性乳腺癌[4]。CHP-1过表达可能是某些肿瘤抑制中心体扩增实现遗传稳定的机制之一，反映了基因的趋同现象，可抵消晚期肿瘤细胞的遗传不稳定性，允许具有染色体组成的细胞克隆性扩增，从而赋予增殖优势，其过表达与肿瘤分级、有丝分裂数和淋巴结阳性相关。因此，在低表达CHP-1的T47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞中，上调CHP-1可增强化疗药物表柔比星和多西紫杉醇的敏感性。

CHP-1+/-小鼠可自发进展为一种类似于人类非典型慢性髓性白血病的致命性骨髓增生性疾病。对自发肿瘤形成CHP-1+/-小鼠的敏感性监测20个月发现，第12个月开始，60%的CHP-1+/-小鼠出现明显的病理体征，如消瘦、脊柱变形和严重制动等衰弱症状；坏死镜检查未发现实体瘤；组织病理分析显示，髓样细胞浸润于心肌、脑组织、肾脏等[29]。CHP-1缺失是ROCK激酶过度激活、中心体扩增和骨髓细胞遗传学异常的重要因素。此外，CHP-1在以非复发性细胞遗传学异常为特征的非典型慢性粒细胞白血病骨髓以及由BCR-ABL癌基因引起的部分费城染色体阳性慢性粒细胞白血病(Ph1 CML)骨髓中均呈低表达，预示其对伊马替尼(费城染色体阳性慢性粒细胞白血病的标准治疗)的反应更差[30]。

CHP-1作为肿瘤抑制剂的方式多样，CHP-1低表达可诱导中心体扩增和细胞遗传学异常；在费城染色体阳性慢性粒细胞白血病中，CHP-1与BCR-ABL信号协同作用，可降低伊马替尼的治疗效果，但低表达CHP-1患者骨髓中的ROCK抑制剂可恢复伊马替尼诱导细胞凋亡的能力，表明ROCK抑制剂联合伊马替尼治疗可以克服低表达CHP-1患者的耐药性[31]。

此外，miR-26b可通过靶向CHP-1蛋白抑制乙型肝炎病毒的转录和复制[32]。CHP-1蛋白(而非CHP-1信使RNA)与miR-26b的 3′非翻译区信使RNA互补，降低miR-26b的过表达。乙型肝炎病毒感染可抑制肝细胞miR-26b的表达，增加CHP-1蛋白的表达。C型尼曼匹克病多见儿童,患儿出生后发育多正常，少数有早期黄疸，常以肝脾肿大为首发表现，多在5～7岁出现神经系统症状，表现为智力减退、语言障碍、学习困难、感情易变、步态不稳、共济失调、震颤、肌张力及腱反射亢进、惊厥、痴呆、眼底可见樱桃红斑或核上性垂直性眼肌瘫痪，患者CHP-1蛋白低表达可能与I1061T突变相关[33]。

6 小 结

CHP-1是系统发育相关的保守蛋白质，人体各器官均有表达，是一种具有调节锌离子能力的金属蛋白，可通过抑制ROCK激酶活性调节中心体的复制，活化HSP90的分子伴侣活性的作用，保护细胞免受致死性应激损伤。CHP-1在乳腺癌、肺癌、非典型慢性粒细胞白血病、乙型肝炎和C型尼曼匹克病均有异常表达，并与肿瘤的发生发展和耐药密切相关，但目前仍主要集中于动物实验研究阶段，尚缺乏相关临床试验研究证据的支持，期待其成为未来抑制肿瘤的新靶点。