腺苷在心肌缺血及远程预适应中的作用

董昊晨，蔺雪峰，韩轩茂，曹洪帅

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内一科，内蒙古 包头 014010)

急性心肌梗死是全球死亡率和致残疾的最主要原因[1]。血运重建技术，包括经皮冠状动脉介入术和溶栓治疗，使缺血心肌组织血液循环重建，功能得到恢复。但有时缺血后再灌注不仅未能使心肌组织功能恢复，反而会加重心肌组织功能障碍和结构损伤[2]。这种在心肌缺血基础上恢复血流后心肌组织损伤反而加重，甚至发生不可逆损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。如何减轻MIRI成为目前主要的难题[3]。随着对腺苷参与缺血预适应研究的深入，腺苷对心脏产生的保护作用及其作用机制逐渐明确。

缺血预适应是指多次短暂的缺血、再灌注可保护心脏免受随后长时间的缺血。许多学者已经证实腺苷可能参与缺血预适应[4-5]。远程缺血预适应是指除心脏外的其他器官(远端器官)在受到短暂的、可逆性的局部缺血后，可诱导心脏对随后发生严重或致命的缺血产生保护作用[6-7]。腺苷作为内源性嘌呤核苷酸，是腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的分解产物，腺苷在远程缺血预适应中通过不同的作用机制发挥关键作用。现就腺苷在参与缺血远程预适应中对心脏的保护作用进行综述。

1 腺苷在MIRI中的作用机制

MIRI是指缺血心肌恢复血流后，病情反而加重，引起心肌组织发生不可逆性损伤。MIRI潜在的病理生理机制尚未完全阐明[1]。介导MIRI的常见机制有Ca2+超载、活性氧类(reactive oxygen species，ROS)增多、白细胞的激活和细胞凋亡程序的启动[8]。

1.1钙超载 1972年Shen和Jennings[9]发现犬的心脏冠状动脉短暂闭塞后，再灌注会导致细胞内Ca2+大量聚集，首次提出了“钙超载”之说。随后有研究进一步表明[10]，细胞内钙超载的主要原因是Ca2+内流增加，而不是Ca2+外流减少。正常情况下，心肌细胞外钙浓度高出细胞内约1万倍，而在缺血期间会出现细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍，严重时可造成心肌细胞的死亡。细胞内Ca2+激活磷脂酶，使膜磷脂降解，进一步增加细胞膜对Ca2+的通透性，Ca2+内流增加，聚集于胞质内的Ca2+被线粒体摄取时消耗大量ATP，进入线粒体的Ca2+与含磷酸根的化合物结合，形成不溶性磷酸钙。而大量钙盐沉积于线粒体造成呼吸链中断、氧化磷酸化障碍，使ATP生成减少。再灌注使线粒体渗透性转导孔开放，既使线粒体呼吸功能抑制，又使细胞色素C及胱天蛋白酶(caspase)增加，启动细胞凋亡。

1.2ROS 生理情况下，体内存在两大抗氧化防御系统(酶性抗氧化剂和非酶性抗氧化剂)可以及时清除ROS，对机体并无有害影响。研究发现，氧化应激是介导MIRI的重要发病环节。在心肌缺血再灌注时，尤其是再灌注阶段，由于黄嘌呤氧化酶形成增多、中性粒细胞聚集和激活、线粒体电子传递链损伤等多重机制使ROS生成增加，引发氧化应激反应[11]。过度增加的ROS通过发生脂质过氧化反应，形成造成心肌细胞损伤的丙二醛，加重细胞内钙超载、线粒体损伤，进一步激活与凋亡相关的蛋白，如细胞色素C释放和caspase的激活，从而发生心肌细胞的凋亡。总之，当线粒体完整性破坏和通透性改变可导致过量的ROS产生，ROS是导致心肌细胞死亡的主要危险因素。缺血再灌注过程中，线粒体电子传递链会产生过量的有害ROS，并引发线粒体氧化损伤和心肌细胞中一系列凋亡事件，最终导致细胞死亡[12-13]。

1.3白细胞的激活 白细胞聚集、活化介导的微血管损伤在MIRI中起重要作用。正常情况下，血细胞位于血管中心流动，与血管内皮细胞基本不接触，保证血液的高速流动。研究发现，心肌细胞发生缺血再灌注时内皮结构会受到严重损伤，促使中性粒细胞黏附于血管内皮上。以犬心肌缺血为例，再灌注仅5 min，心内膜中性粒细胞增加25%，而缺血较轻的组织白细胞聚集较少[14]。缺血和再灌注时中性粒细胞和血管内皮细胞的多种黏附分子表达增强，引起中性粒细胞与受损血管内皮细胞之间广泛黏附、聚集。白细胞黏附血管内皮细胞后不易分离，极易嵌顿、堵塞微循环。同时，激活中性粒细胞与血管内皮细胞本身释放大量的致炎物质，如自由基、蛋白酶、溶酶体酶等和许多具有趋化作用的炎症介质，使微循环中白细胞浸润进一步增加，且氧自由基使细胞内蛋白质交联，蛋白质结构改变并丧失活性，还可引起核酸碱基改变或脱氧核糖核酸断裂，使整个细胞丧失功能。

1.4细胞凋亡 细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞死亡的过程，这被称为程序性细胞死亡的形式之一。凋亡是多因素、多阶段和多基因严格控制的过程，多种蛋白参与其中。包括与促进凋亡相关的蛋白caspase家族、内源性核酸内切酶，其中caspase是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用的蛋白酶，而caspase-9又是细胞凋亡信号的主要执行[15]；抗凋亡蛋白主要有Bcl-2 家族等,其家族成员包括抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡成员Bax、Bak，它们之间的相互作用决定了细胞死亡的阈值。总之，这些蛋白家族分别参与不同的细胞凋亡调控途径，发挥不同的作用，导致细胞呈现凋亡特征性的形态和生化改变。缺血心肌再灌注后，血液供应实现恢复，但缺血期间细胞内氧自由基生成增多和钙离子超载将会启动心肌细胞凋亡程序[16]。

2 腺苷在缺血和远程预适应中的释放

缺血预适应期间释放腺苷在心脏保护中起关键作用。内源性释放(或其外源性给药)后5 min非常重要，这个短时间段是心脏保护的重要时间窗[17]。在缺血预适应中由胞内ATP分解产生的腺苷也起到心脏保护作用。而胞外形成的腺苷在防止心肌局部缺血性损伤中作用较小[18]。缺血预适应过程中也可能会激活迷走神经系统[19]，这可能会增加细胞内腺苷水平[20]。

有许多研究表明，远程预适应介导的心脏保护作用也可能是通过释放腺苷实现的，如在远程预适应刺激前使用特异性腺苷受体拮抗剂或使用靶向消除A1受体的转基因动物，阐明了腺苷在远程预适应中的作用，为腺苷在远程预适应中起关键作用提供了强有力的证据[21-23]。Leung等[15]证明在缺血预适应后分离兔的心脏，收集冠状动脉液，以远程预适应的方式作用于另一动物的体内，产生了心脏保护作用，腺苷受体阻断剂则消除冠状动脉流出物在远程预适应中的作用，提示腺苷可能是心脏的一种保护性体液因子。

外源性给予腺苷受体激动剂可模拟在缺血和远程预适应中心脏保护作用[24-26]。在Langendorff系统中，给予离体大鼠腺苷能减轻其MIRI，同时静脉内给予腺苷可保护大鼠肠缺血再灌注损伤后引发的心脏损伤[27]。药物预处理相对于缺血预适应的潜在优势在于局部缺血预适应功效降低的情况下，外源性给药可以引起预适应。有证据表明在心绞痛和糖尿病患者中，缺血预适应的心脏保护作用被显著消除；腺苷药物预处理对糖尿病和稳定型心绞痛患者疗效显著[28]。

3 腺苷介导心脏保护作用的机制

腺苷可通过激活不同的腺苷受体产生多种生理效应，如调节血流量，心率和心脏收缩力[29-30]。目前已经在不同的组织中克隆和证实了4种类型的腺苷受体A1，A2A，A2B和A3，并且都是G蛋白偶联受体，包括Gi和Gs两类[3,31]。

研究显示，在缺血预适应过程中冠状动脉血液样本(静脉和动脉)和心脏灌注样本会有腺苷水平的升高。腺苷在远程缺血预适应中起关键作用，学者采用不同腺苷受体的选择性激动剂和拮抗剂来探索腺苷预适应的机制。腺苷可通过各种途径诱导对心脏的保护作用，包括激活ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)[32]，增加抗氧化酶水平(谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化氢酶)[25]，与阿片受体之间的相互作用[33]和一氧化氮水平的增加[32]。

3.1KATP腺苷通过KATP通道产生心脏保护作用。Pell等[21]报道A1受体介导的心脏保护作用是通过KATP通道开放实现的。在冠状动脉阻塞30 min和再灌注120 min前用A1受体激动剂2-氯环戊腺苷(cyclopentine adenosine，CCPA)预处理兔可减少心肌梗死面积。用KATP通道阻断剂格列本脲或5-羟基癸酸酯完全消除了CCPA的心脏保护作用，这表明KATP通道可通过A1受体介导心脏保护作用。Tracey等[34]阐明了KATP通道开放在A3受体介导的心脏保护中的作用。局部缺血30 min和再灌注120 min前用选择性A3受体激动剂[N6-(3-chlorobenzyl)-5′-N-methylcarboxamidoadenosine，CB-MECA]灌注并分离的兔心脏产生限制梗死面积的作用。用剂量依赖性A1受体拮抗剂(BWA1433)预处理后并不改变CB-MECA限制梗死面积的作用，证实CB-MECA通过激活A3受体引起限制梗死面积的作用。用格列本脲和5-羟基癸酸酯预处理消除了A3受体激动剂CB-MECA限制梗死面积的作用。这表明KATP通道开放从而激活A3受体产生限制梗死面积的作用。

Takano等[35]证明在兔冠状动脉闭塞30 min和再灌注72 h前，用CCPA或A3受体激动剂(A3 adenosine receptor agonist，IB-MECA)预处理可减少梗死的面积，而应用A2A受体拮抗剂(CGS-21680)并不能阻断上述作用，表明A1和A3受体而不是A2A受体参与缺血预适应。在冠状动脉闭塞 30 min 前立即用5-羟基癸酸酯干预，完全消除了CCPA和IB-MECA减少梗死面积的作用，从而揭示了通过KATP通道开放激活A1和A3受体以产生心脏保护作用[25]。Gopalakrishnan等[36]研究也证实，用腺苷预处理豚鼠膀胱细胞和用KATP通道开放剂(P1075)预处理同样可以打开KATP通道，进一步支持腺苷是通过打开KATP通道而产生效应。Husain和Somani[37]证实腺苷作为药物预处理灌注小鼠心脏，通过保留表面KATP通道亚基可显著减弱缺血性损伤。腺苷预处理可显著防止缺血所造成肌肉KATP通道表达下降。

3.2激活抗氧化机制 腺苷还可以通过增加抗氧化酶的水平发挥心脏保护作用。Dana等[24]报道了A1受体的激活可以使锰超氧化物歧化酶的活性增加。在局部缺血35 min和再灌注2 min前用CCPA预处理减少大鼠的梗死面积。锰超氧化物歧化酶反义寡核苷酸却消除了CCPA减少梗死面积的作用，揭示A1受体的激活增强锰超氧化物歧化酶活性以产生心脏保护作用。

Hochhauser等[25]证明在局部缺血再灌注前灌注A1受体激动剂CCPA和A3受体激动剂2-氯-N6-(3-碘苄)-腺苷-5′-N-甲基酰胺增加了抗氧化酶的水平，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，表明A1和A3受体的激活可能会增加抗氧化酶的水平以产生心脏保护作用。Maggirwar等[38]证明用A1受体激动剂R-苯基异丙基腺苷预处理大鼠会增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的水平。

用非选择性腺苷受体阻断剂茶碱预处理可阻断R-苯基异丙基腺苷介导的抗氧化酶水平升高，表明腺苷受体的激活可增加抗氧化酶水平[37]。另一项研究证明，在培养内皮细胞和心肌细胞时用A1受体激动剂R-苯基异丙基腺苷预处理会增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，用茶碱预处理后逆转R-苯基异丙基腺苷介导的抗氧化酶水平升高，证明了A1受体活化可能会增加抗氧化酶的水平[38]。

3.3一氧化氮生成增加 一氧化氮的前体是L-精氨酸，在一氧化氮合酶的作用下生成。一氧化氮合酶有3种类型：内皮型一氧化氮合酶,主要存在于内皮细胞；神经元型一氧化氮合酶,主要存在于神经元；诱生型一氧化氮合酶,主要存在于单核巨噬细胞系统。一氧化氮具有高度的脂溶性，可扩散至血管平滑肌细胞并激活胞内可溶性鸟苷酸环化酶,使胞内环鸟苷酸水平增高，降低胞质内游离Ca2+浓度，使血管舒张。

有研究表明腺苷可能会增加一氧化氮的水平从而产生心脏保护作用；而一氧化氮水平的增加可能在缺血预适应介导的心脏保护中起重要作用[39]。Li等[40]报道用A2A受体激动剂(CGS-21680)预处理人髂动脉内皮细胞和猪颈动脉内皮细胞后培养基中一氧化氮水平增加。此外，用非选择性A1和A2A受体拮抗剂(CGS-15943)或A2A受体拮抗剂(ZM-241385)预处理可逆转CGS-21680所介导的一氧化氮水平升高，表明A2A受体的活化可导致一氧化氮产生增加。Vials和Burnstock[41]报道腺苷受体的活化可增强一氧化氮介导的血管舒张效应，而用一氧化氮抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯预处理后可抑制腺苷受体活化所介导的一氧化氮舒张血管的效应。研究表明，用A1受体激动剂N6-环己基腺苷进行药物预处理会导致内皮型一氧化氮合酶磷酸化并对小鼠心脏起保护作用[42]。此外，由一氧化氮介导的蛋白质亚硝基化而形成的S-亚硝基硫醇蛋白质增加，表明腺苷可以通过增加一氧化氮水平产生心脏保护作用[42]。

3.4与阿片受体之间的相互作用 阿片受体可能参与腺苷介导的心脏保护作用。Surendra等[33]证实在远端缺血预适应介导的心脏保护作用中δ和κ阿片受体和腺苷A1受体之间相互作用。在远程预适应刺激后从兔体内获得的血浆透析液可以保护离体心肌细胞免受缺血性损伤。δ和κ阿片受体激动剂给药后也产生心脏保护作用。A1受体拮抗剂给药阻断了阿片受体活化所介导的心脏保护作用。此外，Surendra等[33]采用免疫沉淀法证明了A1受体与δ和κ阿片受体物理分子之间的关联。基于这些研究结果，提出腺苷是通过与阿片受体(尤其是δ和κ)之间相互作用从而介导心脏保护作用。另一项研究描述了腺苷预处理介导的心脏保护作用是通过阿片受体介导的，显示对正常大鼠腺应用腺苷后可以提供缺血再灌注损伤之后的心脏保护作用[43]。

然而，在同样剂量下，腺苷未能保护糖尿病大鼠的心脏免受缺血性损伤。但是腺苷再摄取阻滞剂双嘧达莫和腺苷共同给药却恢复了糖尿病大鼠腺苷预处理所介导的心脏保护作用。腺苷在糖尿病大鼠中缺乏心脏保护作用可能是由于腺苷的可用性降低。双嘧达莫导致腺苷可用性增加，可能是恢复腺苷预处理对糖尿病大鼠的心脏保护作用的重要原因。用阿片受体拮抗剂纳洛酮预处理可以消除腺苷预处理对正常大鼠和同时应用双嘧达莫的糖尿病大鼠的心脏保护作用，表明腺苷预处理介导的心脏保护通过阿片受体的激活而介导[43]。

4 小 结

血运重建后的再灌注损伤常会使原有的心肌组织恶化。腺苷预处理有望成为保护心脏强有力的工具，其在MIRI中的作用越来越受人们的关注。随着对腺苷逐渐深入的研究，发现其主要激活A1和A3受体来产生保护效应，这些途径包括增加KATP通道的开放，增加抗氧化酶和一氧化氮的水平，增强与阿片受体之间的相互作用从而实现对心脏的保护。因此，明确腺苷在缺血和远程预适应中具体作用机制的研究显得尤为重要，从而为心肌梗死的患者提供更多的治疗新思路。