HPLC测定史国公药酒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷

罗汉宇，罗滢娟**

（1. 吉安市食品药品检验检测中心，江西 吉安 343000；2. 吉安市疾病预防控制中心，江西 吉安 343000）

史国公药酒是历史悠久且目前仍广泛使用的著名酒剂成药[1-2]，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册，由玉竹、鳖甲、牛膝、桑寄生、防风、川芎等17味中药组成[3]，具有祛风除湿、活血通络的功效，主要用于风寒湿痹、骨节疼痛、四肢麻木。该制剂处方药味多，现有标准采用理化鉴别，难以控制产品质量，目前文献虽有对处方中羌活和红曲化学成分的研究[4]，但未见对处方中防风化学成分研究的报道。本文采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷以检测防风的含量，该方法操作简便，分离度好，为该品种质量标准提高提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Bp211D十万分之一电子天平（德国Sartorias公司）；密里博DQ5超纯水制水机（Merck Millipore公司）。

1.2 试剂

正丁醇（分析纯，国药集团）；甲醇（色谱纯，默克公司）；超纯水（自制）；升麻素苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111522-201712，含量96.2 %）；5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111523-201610，含量96.1 %）；史国公药酒（江西药都樟树制药，批号160701，161101，170301）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-2 % 冰醋酸（40:60）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 µl。理论塔板数按升麻素苷计算，不低于6000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 ml中各含60 µg的混合溶液，摇匀。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取本品25 ml，水浴蒸至约10 ml，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取5次（20，20，10，10，10 ml），合并正丁醇液，加氨试液洗涤5次（20，20，10，10，10 ml），弃去洗液，正丁醇液置水浴蒸干，加甲醇适量溶解并稀释至5 ml，摇匀，滤过。

图1 专属性试验HPLC色谱图

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取除防风药材的其他药材按处方比例，照生产工艺制备空白样品，按2.2.2项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按2.1项色谱条件测定。结果显示，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰分离良好，阴性对照溶液在升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷处无干扰峰，见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取升麻素苷（609.2 µg/ml）5-O-甲基维斯阿米醇苷（613.6 µg/ml）混合对照品溶液1，1，2，1，2，3 ml，分别置50，25，25，10，10，10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 µl注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定。以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标，计算回归方程。升麻素苷回归方程为Y=59.841X-54.543，r=0.9989；5-O-甲基维斯阿米醇苷回归方程为Y=30.21X-48.742，r=0.9983，表明升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷分别在121.84～1827.60 ng、122.72～1840.80 ng范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，按2.1项色谱条件测定，计算峰面积的RSD，结果升麻素苷峰面积RSD为0.63 %，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD为0.52 %，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取样品（批号160701），按2.2.2项下方法制备，室温下放置，分别在0，2，4，8，12，16，24 h测定，结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为0.90 %，0.87 %，表明样品溶液至少在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取样品（批号160701），按2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，根据峰面积计算升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量分别为60.06，52.55 µg/ml，RSD分别为1.13 %，0.98 %，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的史国公药酒（批号161101）25 ml，平行9份，分为3组，分别精密加入混合对照溶液1 ml（升麻素苷浓度分别为48.23，60.16，72.52µg/ml，5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度分别为48.12，60.25，72.36 µg/ml），按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，结果升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷平均回收率分别为98.12 %，97.56 %，RSD分别为0.95 %，0.98 %。

2.9 样品测定

取3批次样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量。结果见表1。

表1 样品测定结果

3 讨论

3.1 测定对象的选择

史国公药酒是祛风除湿、活血通络的药品，防风具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效[5]，是处方中起主要作用的中药材之一。因此，选择防风作为该药酒含量测定的研究对象。

3.2 流动相的选择

作者曾选择甲醇-水、乙腈-水和甲醇-乙腈-水系统进行实验，虽能检测出成分峰，但峰形拖尾，分离度较低，故将流动相改为甲醇-2 %冰醋酸水溶液（40:60），在此条件下各检测成分分离度和峰形良好，能获得满意的结果。

3.3 提取方法和溶剂的选择

史国公药酒含大量蔗糖，曾使用柱层析试图去除试样的糖分，但在去除糖分的同时，也使试样中的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷流失。后改用水饱和的正丁醇提取，正丁醇提取液用氨试液洗涤后，蒸干，加甲醇溶解后测定，此方法既可很好地去除药酒中的糖分和大部分对目标成分测定有干扰的物质，又可避免升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷在制备过程中的损失。

3.4 检测波长的选择

参照防风药材项下的含量测定方法[6]并经实验验证，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷在254 nm波长处均有最大吸收，因此选择254 nm作为测定波长。