三氧化二砷在髓母细胞瘤治疗中对SHH通路抑制机制的研究进展

方黄毅 张 哲 庞 晨 盛汉松

髓母细胞瘤(MB)是儿童中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，约占15岁以下儿童所有脑部肿瘤的20%[1]。MB具有恶性程度高、容易转移、术后易复发等特点。通过对髓母细胞瘤的患者采取手术、放疗及化疗的综合治疗，髓母细胞瘤患者的术后生存率(0.1～20.3年)达到70%。尽管常规疗法对大部分髓母细胞瘤患者有效果，但大多数存活者长期忍受放疗和化疗带来的不良反应，包括发育、神经以及内分泌等方面的失调[2]。因此，寻找更加安全、高效及低廉的靶向抑制治疗具有重要的意义。

在细胞分子研究中，MB包含了多个分子亚型：SHH型、WNT型、第3组型 (group3)、第4组型(group4) 。髓母细胞瘤亚群显示高度不同的细胞遗传学、突变谱和基因表达特征，此外还有不同的临床表型，例如肿瘤细胞组织学和患者预后的差异[3]。SHH型基本为促纤维增生/结节型髓母细胞瘤，好发于婴幼儿和成人，预后较差。在大多数情况下，SHH亚组涉及SHH通路的一个或多个基因(如PTCH1、SUFU或SMO等)的体细胞突变，导致通路异常激活，进一步导致MB的发生。

三氧化二砷(ATO)作为SHH信号通路的一种靶向抑制剂，主要通过抑制SHH信号通路下游GLI蛋白在肿瘤细胞中的特异性表达，从而抑制通路下游的靶基因的过度激活来发挥抑制肿瘤细胞增殖生长的作用[4]。

一、MB中SHH通路的异常表达与调节

SHH信号通路的激活在胚胎发育过程中对于不同组织和器官的增殖分化是必不可少的。在胚胎发育阶段之后，该通路通过控制细胞增殖和分化来促进成体组织的稳定和修复。然而，当这种途径被异常激活时，会导致不同器官肿瘤的产生[1]。在小脑的胚胎发育过程中， SHH信号通路主要通过调控小脑外颗粒层的普肯野细胞(purkinje cell)增殖从而促进小脑发育增殖，但在胚胎期之后仍维持其激活可能导致MB的发生。通路的异常激活在MB中发生机制通常表现为PTCH1或者通路下游基因的突变[5]。SHH信号通路中的SHH蛋白的相对分子质量为45000，具有自催化活性，可分为N端和C端(分别为20000和25000)[6]。SHH的N端羧基发生变化，形成胆固醇，增强蛋白的结合、分泌和转运活性。当SHH与PTCH1跨膜受体结合时，SMO(通常被PTCH1抑制的受体)被释放，经历构象改变，并转移到细胞质中。SMO与细胞质中融合同源物(SUFU)的抑制剂结合，从而释放属于GLI家族的蛋白质。GLI蛋白转运到细胞核，在细胞核中它们作为转录因子调节不同靶点的表达，例如GLI1、PTCH1、CYCLINED和MYC，这些靶点涉及细胞存活、增殖和分化，当这些转录因子异常激活或抑制则可能导致MB的发生[5]。研究表明，GLI家族蛋白中GLI2在SHH激活中起核心作用。GLI1蛋白与GLI2一起转录，但是没有起主要作用，仅作为该通路的激活标记[7]。并且有相关实验表明GLI2基因敲除引起的细胞数目减少是由G0细胞周期阻滞引起的，不会发生细胞凋亡[8]。这些发现表明在MB的治疗中GLI2是可能的治疗目标。导致SHH通路活化的一个机制是抑制调节基因的突变，这种机制的一个例子是PTCH1同源物编码基因的体细胞突变和杂合性丢失[9]。

PTCH是一种 12 次跨膜蛋白受体，SMO是一种 7 次跨膜蛋白受体，属于G蛋白偶联受体超家族的一员。在人类体内发现存在两种PTCH 同源基因为PTCH1 和 PTCH2，PTCH蛋白位于细胞膜表面，具有两种功能， 一是与SHH 蛋白结合，二是抑制 SMO 蛋白。当PTCH1同源物编码基因发生改变，SHH 蛋白与 PTCH结合， PTCH 对 SMO 的抑制作用就被解除，SMO 将信号向胞内传递，可导致MB发生。有研究发现，两个GLI等位基因的失活导致PTCH杂合小鼠中MB的形成，这表明SHH信号可以独立指导肿瘤的发生[7]。SHH的激活还涉及其他基因的突变，婴儿和成人中最常见的是SUFU和SMO突变[7]。在4～17岁的患者中TP53基因突变占到50%。这些结果表明考虑患者的年龄范围和存在的遗传改变，可以更好地指导MB的治疗。此外，其他信号通路可与SHH通路发生交叉调节。通过血管内皮生长因子(EGF)和重组SHH(N-shh)刺激可上调细胞中PI3K、MAPK和SHH信号通路的表达，细胞表面生长因子(EGF)通过EGFR介导的信号的诱导强烈激活ERK1/2和AKT[10]。ERK1/2和AKT通过上调SHH下游靶基因GLI1的转录水平且不影响GLI3A/GLY3R比值来增强SHH通路活性。这些信号通路抑制剂的联合使用是MB靶向治疗的一种潜在的选择。

二、当前针对SHH通路的靶向治疗

SHH通路抑制剂是一类针对SHH通路基因异常激活进行靶向治疗的药物，天然甾体生物碱环杷明(cyclopmine)是最早发现具有SHH通路抑制活性的药物之一。它通过选择性地结合SMO发挥作用，具有抑制细胞增殖分化和体内肿瘤转移的能力[11,12]。这些发现也促进了包括vismodegib(GDC-0449)在内的SMO抑制剂类药物的发展[13]。首例接受SHH髓母细胞瘤治疗的成人患者对vismodegib迅速产生耐药性，后来发现其SMO点突变D473H，D473H突变破坏了vismodegib与SMO的结合能力，导致耐药性的发生[14]。有研究发现，vismodegib和mebendazole联合使用可抑制SHH信号通路[13]。mebendazole是一种抗寄生虫药，通过抑制原纤毛的形成来抑制SHH信号通路的异常激活，这对于SMO突变的肿瘤细胞具有一定的抑制效果。此外，SHH信号通路上游的小分子抑制剂被证明能够有效抑制SHH通路的异常表达。Robotnikin是该通路上游常见的小分子抑制剂，它能够与SHH蛋白竞争性结合，拮抗SHH蛋白与PTCHI受体结合从而抑制SHH信号通路异常表达[15]。但是，在SHH基因发生突变时，这种抑制剂也可能会失去作用。所以，多种SHH信号通路靶向抑制剂的联合使用可能减少耐药性的发生。

有研究表明SHH型髓母细胞瘤尤其是合并有GLI2转录活跃的患者，其预后往往较差，拮抗SHH信号通路下游GLI基因的异常激活，可能能够提高患者的预后[16]。GANT61、GANT58是SHH信号通路下游的GLI常见的转录拮抗剂，它们通过与GLI基因位点特异性结合，拮抗GLI蛋白转录活性从而抑制SHH信号通路的异常激活[17]。所以，SHH信号通路下游基因位点的靶向抑制对肿瘤治疗同样具有重要的作用，而且为解决抑制剂耐药性等问题提供了新的思路。

三、ATO作用机制

ATO作为一种已知的用于治疗急性早幼粒细胞白血病M3的药物，其对早幼粒细胞白血病蛋白(PML)的影响已经得到很好的证实。ATO通过与目标蛋白附近的半胱氨酸的巯基直接相互作用而发挥其生物效应[7]。在SHH通路的研究中ATO主要通过抑制GLI2在纤毛积聚并促进GLI2降解从而抑制肿瘤生长。研究表明，砷与微管蛋白相互作用影响GLI蛋白向纤毛的转移能力，并且这种作用可以通过破坏GLI蛋白结构来介导[18]。相关实验还表明ATO抑制生长的作用与GLI蛋白水平有关，ATO影响了几种GLI1或GLI2蛋白表达水平高的肿瘤细胞系的生长，但对GLI蛋白表达水平低的细胞系影响不大，这提示对于患者的预后有积极作用。在与人类肿瘤高度相似的小鼠胚胎肿瘤实验中，用ATO处理后SHH通路中多个靶基因蛋白(PTCH1、GLI1和GLI2)显著下调，同时检测到肿瘤细胞中Ki67 蛋白减少，表明ATO通过抑制SHH信号通路下游的靶基因的过度激活而发挥抑制肿瘤细胞增殖生长的作用[19]。人骨肿瘤的实验研究表明，ATO还可通过促进DNA损伤积累导致肿瘤细胞凋亡[20]。上述研究均提示ATO对于SHH信号通路异常激活的肿瘤细胞有着良好的抑制作用，尤其是在对SMO抑制剂产生耐药性的情况下。在治疗MB的药物实验中，ATO与SHH通路的其他靶向抑制剂联合使用能够更加有效地抑制MB的生长。在与ATO研究相关动物实验中，伊曲康唑作为SMO的一种特异性抑制剂与ATO联合治疗MB有着不错的效果，在PTCH阳性和TP53阴性的动物身上进行两种药物的试验，发现对肿瘤体积的减少有协同作用[7]。许多研究表明ATO与SHH通路其他靶基因抑制剂联合使用能够更有效地拮抗通路多种靶基因的异常表达，从而抑制MB的生长。

四、ATO在MB治疗的前景

当前对MB治疗的策略还处于探索之中。早期研究集中在SHH通路及其组分PTCH1、SMO和SUFU，并开发阻断通路的特异性药物。治疗初期，药物干预的临床结果是积极的。然而，在一段时间的治疗后观察到耐药性。相对于通路中PTCH1和SMO，下游GLI基因是一个探索较少的基因，对该基因进行靶向抑制可能将会更有效地拮抗SHH通路的异常激活。所以，直接阻断GLI的药物可能将被包括在标准治疗方案[多药化疗和(或)放疗]中。ATO是具有独特的历史、丰富的临床应用和良好的中枢神经系统渗透性的药物，目前仍在白血病以外的领域对其进行研究。在涉及SHH通路的MB中ATO的临床前研究已经得到证明，在联合化疗的MB动物模型中，该药物的评估也较为良好[5]。