PCSK9抑制剂与低密度脂蛋白水平的研究进展

罗群华 黎明江 王 鑫

血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是冠心病的危险因素，积极降低LDL-C能显著减少冠心病的致残率和致死率[1]。大量的临床试验证明，降低LDL-C没有下限，对于高风险患者更低的LDL-C水平可能更有益[2]。他汀类药物是目前降低LDL-C水平的重要药物，但他汀类药物即使在初始剂量基础上药物剂量翻倍，降脂获益仅增加6%，被认为是“他汀的瓶颈”[3]。而且，目前最大耐受的他汀类药物治疗剂量可能不足以充分降低LDL-C水平[4]。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/ kexin 9型(PCSK9)抑制剂是降脂药的新起之秀，能显著降低LDL-C，并且在家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)、他汀类药物不耐受的患者或已经服用最大剂量他汀类药物但仍需要脂质减少的患者中可能特别有益。在不同的高风险患者组中，针对PCSK9的人单克隆抗体可以将LDL-C水平降低55%～72%[5]。而且，最近已报道PCSK9单克隆抗体在大规模临床试验中可显著降低心血管事件发生率。本文将对PCSK9分子结构及其作用机制、PCSK9抑制剂的分类及相关临床研究进展进行综述，评价PCSK9抑制剂对降低LDL-C水平的有效性及应用的安全性。

一、PCSK9的分子结构

PCSK9是一种肝酶，是由692个氨基酸残基组成的糖蛋白，在分泌型丝氨酸蛋白酶家族中是第9个被发现的前蛋白转化酶，是继LDL受体基因和载脂蛋白B基因后，发现的第3个可致常染色体显性高胆固醇血症的第3个基因。它主要存在于肝脏，可以调节LDL-R并因此调节LDL-C水平[6]。PCSK9的人22kb基因位于染色体1p32的小臂上，含有12个外显子和11个内含子，其表达和合成受甾醇调节元件结合蛋白2和肝X受体调节[7]。PCSK9最初合成为称为pro-PCSK9的75kDa可溶性酶原，其含有N-末端信号肽、前结构域、催化结构域和富含半胱氨酸-组氨酸的C-末端结构域。pro-PCSK9在内质网中的自催化裂解，释放出信号肽、前结构域和60kDa成熟蛋白，紧接着前结构域与成熟蛋白质结合，促进其转到高尔基体并形成成熟的PCSK9，然后在细胞内直接起作用或是被分泌进入循环。

二、PCSK9的作用机制

正常过程中，LDLR通过载脂蛋白B(apoB)结合LDL-C，将其内吞入肝细胞内并靶向溶酶体，引导其进行降解，而且LDL-R可以反复循环引入数百个LDL颗粒进入细胞。而PCSK9通过结合LDL-R抑制了该循环，使得LDL-C难以进入肝细胞进行降解，从而发挥其调节LDL-C的作用。当细胞内胆固醇降低时，PCSK9转录表达，抑制LDL-R的活性[5]。

1.PCSK9在肝细胞内外参与LDL-C代谢:PCSK9可以在肝细胞内外直接与LDL-R受体结合从而阻止循环，也可分泌入血后先与LDL-C颗粒结合然后再在肝细胞外作用于LDL-R受体。当细胞内胆固醇水平降低时，PCSK9开始转录表达。PCSK9可以与LDL-R的表皮生长因子前体同源结构域A结构域结合，并与受体一起内化[8]。在内体中存在的酸性条件下，LDL-R和PCSK9之间的亲和力增加。PCSK9的结合导致LDL-R的构象变化，这阻止了LDL-R的正常再循环。但是，尽管PCSK9进入细胞依赖于LDL-R，但大部分内化的PCSK9在细胞内会滞留数小时[5]。这个时间滞后表明包含有PCSK9和LDL-R的内含体不会导致配体和受体立即靶向溶酶体，并且可能存在允许单个PCSK9分子返回表面并作用于新LDL-R的循环回路。这种相互作用模式(LDL-R导向溶酶体时配体再循环)不同于与含apoB的脂蛋白(LDL-R再循环时配体导向溶酶体)的典型相互作用。

2.PCSK9在血液中参与LDL-C代谢:当PCSK9被分泌入血后，其中的一半可以与LDL颗粒或脂蛋白α颗粒结合，另一半有的成为高密度脂蛋白(HDL)的一部分，有的游离于血浆中。有趣的是，与LDL结合的PCSK9大多数处于完整形式，而自由循环的PCSK9主要是作为弗林蛋白酶切割的较短蛋白质，对LDL-R的亲和力可能降低[9]。而血浆中LDL颗粒浓度较PCSK9高出很多，平均每500个天然LDL颗粒可以与1个PCSK9蛋白相配对。那么，很容易推测出，存在这样一种细胞外随机过程，细胞外结合有PCSK9的LDL-C颗粒在进入肝细胞时，PCSK9与LDL-R结合，介导LDL-C及LDL-R一起靶向溶酶体，但是结合有PCSK9的LDL-C颗粒几乎500个里面只有1个。不难想像，肝脏就是这么调节LDL并最终控制全身胆固醇体内平衡。这也为单个LDL-R分子在失活前能够循环数百次提供了合理的解释[10]。这个过程依赖于复杂和精细的细胞调节机制，如甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)和肝X受体转录途径。

3.PCSK9在动脉斑块中参与LDL-C代谢:PCSK9可自由循环通过动脉斑块中的细胞外空间，此外，斑块巨噬细胞和平滑肌细胞可以分泌PCSK9并可以受其作用。这意味着在正常情况下，动脉粥样硬化细胞中的LDL-R表达受PCSK9局部浓度的调节[11]。与肝脏不同的是，斑块在有效摄取脂蛋白胆固醇后，可能诱导斑块局部进展或不稳定。可以设想，治疗性PCSK9抑制可以在斑块细胞中产生LDL-R的上调，从而导致粥样斑块中胆固醇积累的增加。

PCSK9对动脉粥样硬化的影响包括对LDL代谢的全局影响，对动脉粥样硬化病变内LDL代谢的局部影响，以及对其他致动脉粥样硬化机制如炎症的影响。动脉粥样硬化是动脉壁的慢性炎性疾病，其特征在于内皮细胞活化、单核细胞和血管平滑肌细胞的积聚。动脉粥样硬化病变是位点特异性的，并且在低切应力区域优先发展。低切应力增加人和小鼠内皮细胞和平滑肌细胞PCSK9的表达，PCSK9表达与单核细胞趋化性和低切应力区黏附之间的关联表明PCSK9与炎症之间呈相关性[12]。PCSK9这种在血管壁中的直接促炎作用，可能通过作用于LDL-R相关蛋白1(LRP1)，对斑块巨噬细胞的炎症方面发挥强烈的调节作用。有研究表明，LRP1的缺失可以诱导炎症，而斑块中的PCSK9可以降低LRP1水平[13]。那么斑块中的高浓度PCSK9有促炎作用，这与其在斑块中下调LDL-R、降低LDL-C的作用恰恰相反。因此，通过单克隆抗体对PCSK9的治疗性阻断可能具有正面和负面效应的组合，尽管其对血浆LDL-C减少有巨大效益，但在临床研究中到底获益如何还需进一步评估。

三、PCSK9抑制剂

PCSK9抑制剂通过阻断PCSK9对LDL-R的降解，降低循环LDL-C水平。根据其作用机制不同，可分为3类：①单克隆抗体或模拟抗体蛋白物：直接抑制PCSK9蛋白与LDL-R结合;②反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)：通过基因沉默作用来抑制 PCSK9 转录合成;③作用于PCSK9蛋白催化部位的低分子肽类：这些肽类可与PCSK9蛋白的催化部位结合使其发生变构，进而影响到 PCSK9 蛋白与LDL-R结合。

1.PCSK9抑制剂-单克隆抗体:在针对PCSK9开发的几种单克隆抗体中，evolocumab和alirocumab这两种已被批准用于临床。两者都是皮下使用的全人单克隆抗体。

(1)evolocumab：evolocumab的给药剂量以每2周140mg或每月420mg。这两种剂量均可以使血浆LDL-C水平产生相似程度的降低[14]。在Ⅲ期临床试验中，无论是作为单药治疗，还是加入他汀类药物治疗，还是对他汀类药物不耐受或给予杂合子FH的患者，该剂量的evolocumab均可使血浆LDL-C水平降低约60%[15]。总体而言，血浆LDL-C水平的降低在不同的临床亚组中高度一致。此外，无论基线血浆PCSK9水平如何，evolocumab均可降低LDL-C水平。

(2)alirocumab:多种alirocumab给药方案已用于Ⅲ期临床试验。一种方案是基于血浆LDL-C水平降低程度的效价剂量：患者从每2周75mg alirocumab开始，然后如果LDL-C水平≥70mg/dl，则剂量将增加至每2周150mg。一般来说，这种方法可使LDL-C水平降低45%～50%，无论是单药治疗，还是加用他汀类药物治疗或对于他汀类药物不耐受的患者[16]。在这些试验中，alirocumab的最大剂量，每2周150mg，血浆LDL-C水平降低约60%，这与evolocumab所示的相似。在另一项试验中，每4周300mg的alirocumab方案将血浆LDL-C水平降低55%～60%。数据显示，在杂合子FH患者中，alirocumab治疗使LDL-C水平降低约40%～60%。在纯合子FH患者中，根据患者的基因型，用alirocumab治疗观察到的LDL-C水平下降范围为7%～64%不等[17]。

(3)单克隆抗体可升高循环中PCSK9水平:针对PCSK9的两种目前可用的抗体，其在循环中与PCSK9以约1∶1的化学计量比结合并禁止其与LDLR结合，从而产生导致LDL-R大量积累且PCSK9缺陷的状态。在肝细胞膜上，LDL颗粒加速清除，血浆LDL-C水平大幅下降。皮下注射75～150mg的alirocumab或140～420mg的evolocumab引入了大量过量(相对于目标超过100∶1)的抗体，在给药的短短几个小时内捕获所有循环的PCSK9并将在接下来的几天捕获所有新分泌的PCSK9[18]。报告治疗患者中几乎没有游离PCSK9的数据，也就未能全面反映注射抗体后循环中PCSK9的情况，因为这种抑制PCSK9的方法实际上导致血液中靶标的大量积累。使用靶向单克隆抗体的患者PCSK9的总血浆浓度平均增加10倍，而在某些个体中甚至增加20倍[19]。这种极端积累有不同的解释：①因为PCSK9不再能够获得更有效的LDL-R途径，PCSK9的清除速度之前减慢许多；②注射后几天新产生的PCSK9将被捕获，并与治疗性抗体混合在循环中；③也有可能是肝脏对PCSK9分泌的上调。

单克隆抗体治疗诱导血管中PCSK9积聚作为免疫复合物的一部分，这一事实在评估PCSK9抑制剂的耐药性时，可用作第一步诊断标志物，确认升高的血浆PCSK9将意味着抗体已经达到抗性作用，而正常水平的PCSK9将表明患者依从性、注射技术问题或者存在对循环中抗体的自由分布的皮肤病学、淋巴系统或系统性障碍的问题[19]。最后，因为近50%的PCSK9存在于LDL颗粒上，所以假定通过注射单克隆抗体产生的大部分免疫复合物将与LDL结合是合理的。这是否与干预的生化或临床功效相关尚不清楚，但可以作为研究工具来识别携带PCSK9的LDL亚群。

2.PCSK9抑制剂的安全性:到目前为止，所有2期和3期研究都强烈提示alirocumab和evolocumab的安全性极佳，包括达到LDL-C水平<15mg/dl的试验参与者。最常见的治疗后出现的不良反应为局部注射反应，其他少见的包括类固醇激素和维生素水平的变化，还有神经认知障碍以及感染和癌症的风险[20]。目前使用PCSK9抑制剂的安全性数据在开放标签延伸试验中延长至52～78周[21]。在FOURIER的开放标签延伸试验中将继续监测极低LDL-C水平的长期安全性。

3.PCSK9抑制剂和他汀类药物:根据临床试验证据，对于正在服用他汀类药物和(或)依泽替米贝在内的最大耐受性口服治疗，LDL-C水平仍达70mg/dl的高风险患者，推荐使用PCSK9抑制剂降低LDL-C。众所周知，服用他汀类药物的患者中有5%～20%会出现他汀类药物相关的肌肉症状[22]，这可能导致他汀类药物强度不理想。PCSK9抑制剂和他汀类药物有一些相似之处和一些重要差异。在最高剂量下，他汀类和PCSK9抑制剂均使血浆LDL-C水平降低约60%。他汀类药物倾向于比PCSK9抑制剂更能降低血浆甘油三酯水平(25%～35%∶15%)[20]。不过，在降低血浆脂蛋白B的水平上，这两者没有差异。但是，PCSK9抑制剂使血浆脂蛋白A的水平降低约25%，而他汀类药物不会降低，甚至可能增加血浆脂蛋白A水平。相比之下，他汀类药物似乎具有抗炎作用，例如他汀类药物治疗后血浆中C反应蛋白水平可降低，而PCSK9抑制剂对通过高敏感度检测测得的C反应蛋白水平没有影响[23]。除了LDL-C水平之外，PCSK9抑制剂和他汀类药物对其他参数的不同作用是否会转化为临床风险降低的差异，仍然是一个尚未解决的问题。

4.PCSK9抑制剂可显著降低ASCVD事件风险:许多前瞻性队列研究、自然随机化研究和随机临床试验证实血管绝对暴露于低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与心血管事件的风险之间存在对数线性关联[23]。临床试验已证明，PCSK9抑制剂可以使心血管事件减少，特别是对于近期急性冠状动脉综合征、多支冠状动脉疾病或外周动脉疾病的患者。降低LDL-C可能没有下限，当LDL-C显著降低至<20mg/dl的水平时，常伴随着甚至更低的动脉粥样硬化心血管疾病事件发生率[24]。用完全人PCSK9单克隆抗体降低顽固性高LDL-C，可能有更有利的安全性特征。

大量的动脉壁成像研究已经证明了降脂药可以减轻动脉粥样硬化斑块的负荷和延缓其进展。有证据表明，当LDL-C水平低于70mg/dl时，动脉粥样硬化斑块会出现倒退。GLAGOV研究评估了evolocumab对斑块成分的影响。与继续他汀类单一疗法组比较，用evolocumab和他汀类药物疗法组合治疗的患者中可以观察到斑块钙化的增加[25]。这表明，强化脂质降低会导致斑块消退和钙化，这可能会稳定斑块并减少心血管事件。

四、临床心血管试验

迄今为止，3项随机、双盲、安慰剂对照的心血管预后试验评估了PCSK9抑制剂的疗效。

1.FOURIER试验：evolocumab的FOURIER试验是PCSK9抑制剂首次成功完成的心血管试验[20]。共有27564例患有临床明显ASCVD的患者，特别是具有心肌梗死(myocardial infarction，MI)、非出血性卒中或症状性外周动脉疾病病史的患者，参加了该试验。在试验过程中，与安慰剂比较，evolocumab治疗显著降低了主要终点风险的15%(HR=0.85,95%CI：0.79～0.92)和主次要终点降低20%(HR=0.80,95%CI：0.73～0.88)。致死性或非致死性MI、致死性或非致死性脑卒中和冠状动脉血运重建的风险显著降低(21%～27%)。evolocumab的临床益处在人口统计学亚组中基本一致。重要的是，基线LDL-C水平亚组的益处也是一致的，包括基线LDL-C水平<70mg/dl的患者，其中与安慰剂比较，evolocumab将LDL-C降低至21mg/dl并对于心血管风险、死亡、MI或脑卒中等风险降低30%(HR=0.70,95%CI：0.48～1.01)。

2.SPIRE-1和SPIRE-2试验：对于bococizumab的SPIRE-1和SPIRE-2试验的结果与FOURIER试验的结果是同时提出的。在认识到由于中和抗体的开发，人源化但非完全人单克隆抗体bococizumab对血浆LDL-C水平降低的影响不能持续时，申办者提前终止了这些试验。

3.ODYSSEY结果试验：鉴于结果尚未公布，2018年3月美国ACC科学会议上提出的ODYSSEY结果试验的结果应视为初步结果。在住院治疗MI或不稳定型心绞痛后1～12个月，共有18924例患者参加了ODYSSEY试验。在试验过程中，与安慰剂比较，alirocumab显著降低了主要终点的风险15%(HR=0.85,95%CI：0.78～0.93，P=0.003)。alirocumab对复合终点的各个组成部分(包括冠心病死亡)的影响是方向一致的。值得注意的是，在ODYSSEY结果试验中，ACS与随机化之间的时间间隔要短于FOURIER试验。但有证据表明，ACS患者在前面的降脂试验中发现的事件曲线的早期差异可能与降低C反应蛋白水平相关，其影响可能比LDL-C水平降低更大。PCSK9抑制剂可有效降低LDL-C水平，但对C反应蛋白水平没有影响。

尽管近年来取得了重大进展，但PCSK9抑制剂作为降低ASCVD风险的策略仍处于起步阶段。目前，PCSK9抑制剂用于ASCVD一级预防的用途仅限于那些患有FH的患者。尚未确定早期和侵袭性LDL-C降低与已证实的疗法(PCSK9抑制剂)是否可以预防年轻、有风险的患者的动脉粥样硬化。除了目前可用的单克隆抗体外，还开发了每年1次的疫苗和每年2次的皮下注射，这两种方法都更方便。 Inclisiran是一种靶向PCSK9 mRNA的小干扰RNA，导致肝脏中PCSK9合成减少，似乎接下来有希望降低LDL-C的新热点。在第1天和第90天给予300mg剂量后，然后每6个月注射1次，inclisiran可以将LDL-C水平降低至53%。LDL-C的这种减少类似于每2～4周施用的alirocumab和evolocumab所实现的减少。鉴于其与单克隆抗体比较具有根本不同的作用机制，使用该药剂计划的更大规模的ASCVD结果，随机临床试验是必不可少的。

五、展 望

综上所述，PCSK9时代的心血管风险预防领域已经开始到来。即将发生的影响可能是在某些临床实践指南中重新引入LDL-C效力监测，并建议甚至更普遍的更严格的目标LDL-C水平。PCSK9抑制剂现已被证明是临床医生用于治疗血脂异常的有效补充。通过使血浆LDL-C水平降低约60%，显著降低主要血管事件的风险，除注射部位反应外几乎无其他不良反应。具有高ASCVD负担的患者发生主要血管事件的风险会增加，这类人群会受益于PCSK9抑制的相对和(或)绝对风险降低。在PCSK9抑制试验中观察到的临床益处发生在将血浆LDL-C降低至约20mg/dl的水平，表明应采用更具侵袭性的LDL-C靶标。如果PCSK9 siRNA抑制剂的临床疗效和安全性得到验证，这些疗法可以提供更早和更容易干预治疗血脂异常的机会，并可能在很大程度上根除冠心病。