丙型肝炎病毒感染患者血清外泌体miR-122的表达量及临床意义探讨

宋晓菲，徐元宏

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)持续感染可导致慢性肝炎、肝硬化甚至是肝癌，严重危害人类健康。近期研究[1]揭示了微小RNA(miRNA)在HCV增殖和发病中的作用。微小RNA-122(miR-122)是肝脏中含量最丰富的miRNA，一些临床研究[2-3]显示miR-122与肝损伤相关，表现为和谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) DNA表达水平相关，因此miR-122也被认为是一种新的肝损标志物。外泌体是由细胞膜内陷后通过一系列复杂的机制形成的微囊泡结构，外泌体中包含蛋白质、脂肪及核酸,双层脂质膜结构可以保护这些内容物不被酶所降解,外泌体是细胞间信息交流传递的重要载体[4]。存储在外泌体中的循环miRNA具有足够的稳定性，该研究的主要目的是检测HCV患者中血清外泌体中的miR-122的表达水平，探讨miR-122是否能作为HCV患者肝损的标志物。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2017年1月～2018年1月在无锡市第二人民医院筛查出HCV感染者40例，诊断符合《丙型肝炎防治指南》[5]，其中男22例，女16例，年龄18.0～67.0岁(中位年龄42.8岁)。其中28例基因分型为HCV-1b，非HCV-1b共计12例(HCV-2a，HCV-3a，HCV-3b和HCV-6a)。其他原因的肝脏损害疾病排除在外，包括乙肝、丁肝、戊肝、己肝、合并艾滋病、肝硬化、肝癌等。所有患者接受了以聚乙二醇干扰素联合利巴韦林为基础的治疗。选了20例健康体检者作为对照组，其中男12例，女8例，年龄20.1～70.0岁(中位年龄46.0岁)。所有患者接受了以聚乙二醇干扰素联合利巴韦林为基础的治疗，按照疗效分为持续病毒应答组 (sustained virological response, SVR)和非持续性病毒应答组(non-sustained virological response, NR)，前者为接受治疗后获得了持续性病毒学应答或完全清除了丙肝病毒，后者为治疗后未获得病毒应答或一直持续高病毒水平。所有研究对象均知情并签署了知情同意书。每位研究对象采集2～3 ml静脉血。

1.2仪器和主要试剂Real-Time PCR 仪购自美国Thermofisher公司；酶标仪购自美国Molecular Devices公司；低温离心机、移液器购自德国Eppendorf公司；电泳仪、转膜仪购自美国Bio-Rad公司；马尔文NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析仪购自英国Malvern Instruments 公司， CD63、CD9、TSG-101抗体、抗-HCV诊断试剂盒，HCV核酸定量检测试剂盒购自上海释物生物科技有限公司； RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miR-122实时定量PCR引物、丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)购自上海吉凯生物有限公司；PVDF filter 购自美国Millipore公司。

1.3miR-122荧光定量PCR用RNA提取试剂盒提取血清中的microRNA，RNA逆转录采用Taqman microRNA 反转录试剂盒和miRNA特异性茎环引物，具体步骤参考试剂盒说明书。逆转录反应体系如下：5 μl RNA，2 μl逆转录缓冲液，0.25 μl dNTP(100 mmol/L),4 μl 逆转录引物(1 μmol/L),0.5 μl逆转录酶(50 U/μl)，0.25 μl Rnase抑制剂(20 U/μl)，12 μl RNAase-free去离子水；反应条件：16 ℃、30 min； 42 ℃、30 min； 85 ℃、5 min。采用Taqman microRNA定量PCR试剂盒对miR-122进行实时荧光定量PCR，引物、反应体系和反应条件参考文献[6]，采用U6为内参，标准化CT：ΔCt=CTmiR-122-CTU6。血浆中miR-122的含量使用2-ΔΔCT法计算，ΔΔCT=(CTmiR-122-CTU6)实验组-(CTmiR-122-CTU6)对照组。

1.4外泌体的分离鉴定血清预先用0.22 μm PVDF filter 过滤，按照文献[7]超速离心的方法收集外泌体，提取的外泌体利用电镜负染的方法观察其形态，利用NanoSight NS300 进行外泌体大小测定和定量分析。利用Western blot 检测外泌体表面标志性marker-CD63、CD9和肿瘤易感基因 101 蛋白(TSG-101)等方法对外泌体进行鉴定。

2 结果

2.1HCV患者的一般临床特征两组的一些常规的生化指标，包括血清白蛋白(Alb)、总胆红素(TBIL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)以及其他各项指标如白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、葡萄糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、高密度脂蛋白(HDL)等。Alb、TBIL、LDL在HCV患者中较健康人水平下降，而ALT、AST水平在HCV患者中较健康人升高，WBC、RBC、GLU、LDH、HDL等其他指标在两组之间差异无统计学意义。见表1。

2.2血清外泌体分离鉴定在HCV患者和对照组提取的血清外泌体中检测到CD63、CD9和TSG-101，提示血清外泌体提取成功(图1)。

图1 HCV患者和健康对照者的血清外泌体标志物CD63、CD9和TSG-101表达

2.3HCV患者和健康对照组中血清外泌体miR-122的表达水平HCV组血清外泌体中miR-122的表达量均较健康对照明显降低，但是HCV-1b组的miR-122表达量比非HCV-1b组略高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A。 HCV组(包括HCV-1b和非HCV-1b组)中外泌体miR-122的表达量与AST和ALT之间的相关性：HCV组中miR-122的表达量与AST的相关系数r=-0.22, miR-122表达量与ALT的相关系数r=-0.29，提示HCV组中miR-122的表达量与AST或ALT的表达量负相关，但相关性弱。

2.4HCV患者和健康对照组中血清循环miR-122的表达水平血清循环miR-122的水平见图2B。HCV-1b和非HCV-1b组的血清循环miR-122表达量较健康人降低，同样的，HCV-1b组的血清循环miR-122表达比非HCV-1b组的表达高(P<0.05)，见图2。HCV患者中(包括HCV-1b和非HCV-1b组)血清循环miR-122和ALT、AST相关性显示：血清循环miR-122和ALT、AST呈负相关，前者相关系数r=-0.522，后者相关系数r=-0.39。

表1 HCV患者(HCV-1b和非HCV-1b)和健康对照组一般情况比较

P1：HCV-1b组与健康对照组比较;P2：非HCV-1b组与健康对照组比较

图2 HCV-1b组、非HCV-1b组和健康对照组的血清外泌体miR-122和血清循环miR-122表达量

A：三组中血清外泌体miR-122的表达量；B：三组中血清循环miR-122的表达量；非HCV-1b组与健康对照组比较：*P<0.05；HCV-1b组与健康对照组比较：&P<0.05；非HCV-1b组与HCV-1b组比较：#P<0.05

2.5不同基因型患者miR-122表达水平与疗效初步分析本研究的28例HCV-1b型患者，其中20例为SVR，其余为NR；12例非HCV-1b型患者中，有4例为SVR，其余为NR。 计算SVR的患者和NR患者血清循环和血清外泌体miR-122表达量， 血清循环miR-122在SVR患者中表达量明显高于NR患者(P<0.05)，但血清外泌体miR-122在SVR患者和NR患者中表达量差异无统计学意义。见图3。

3 讨论

血清循环miR-122被认为是一种新的预测肝功能损伤的生物标志物[8-12]。本研究中，HCV患者血清循环miR-122的表达量较正常人降低，并与AST和ALT表达水平呈负相关。目前关于HCV患者血清循环miR-122的表达趋势尚有争议，张庆 等[13]和Bihrer et al[14]研究显示慢性HCV感染者血清循环miR-122表达高于健康对照组，而Jiao et al[15]研究表明血清和外泌体中miR-122在各个丙肝基因型组中均低于对照组，造成这样的原因为这几个研究纳入患者和样本量大小不一样，张庆 等[13]的研究主要纳入的为慢性丙肝、肝硬化、肝癌患者，Bihrer et al[14]主要纳入的也为慢性丙肝患者，本研究和Jiao et al[15]研究纳入的患者群并非限定在慢性丙肝感染，可能在丙肝进程的不同阶段miR-122表达量会不同，后续研究中也会关注这点。

图3 SVR组和NR组的血清外泌体miR-122和血清循环miR-122表达

A：血清泌体miR-122的表达；B：血清外循环miR-122的表达；与SVR患者比较：*P<0.05

外泌体是一种稳定有效的细胞间信号传递和交换方式，包含蛋白质、信使RNA和微小RNAs等，这些内容物在外泌体的保护下不易被降解[16]。在本研究中，外泌体源性miR-122与血清循环miR-122表达趋势类似(消长一致)，在HCV患者中表达水平低于健康人群，此外，外泌体源性miR-122与AST和ALT之间也存在着负相关，只是负相关性比血清循环miR-122和AST/ALT弱。这些结果提示外泌体源性miR-122虽然稳定性比血清循环miR-122稳定，但是准确性上可能不如血清循环miR-122。

临床HCV治疗方案主要为干扰素和利巴韦林，但疗效差异较大， HCV最常见有5种基因型(1a、1b、2a、3a、6a)，我国主要为以1b型最多见(约占70%)，有研究[15]认为不同基因型HCV与疾病严重程度有一定相关性。本研究观察到HCV不同基因型之间的血清循环和血清外泌体中的miR-122表达量存在差异，HCV-1b组miR-122表达量略高于非HCV-1b组，这与Jiao et al[15]的研究结果基本一致。也有研究[14]报道miR-122可作为HCV治疗成功的预后标记，本研究也对此进行了初步的探讨，SVR为治疗有效，而NR则为效果不佳，本研究结果提示，获得SVR的患者血清循环miR-122高于NR的患者，但是血清外泌体miR-122在SVR组和NR组之间的差异无统计学意义，提示血清外泌体miR-122可能不具备预测治疗效果的可能性。但是治疗效果的影响因素众多，即便是血清循环miR-122在SVR组和NR组之间存在差异，血清循环miR-122预测治疗效果的能力仍有待深入探讨。