HOTAIR与前列腺癌的研究进展

梁栋国，王雅婷，罗睿宇，魏 强 综述 吕世栋 审校

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是源自前列腺上皮的恶性肿瘤，好发于中老年男性，近年来有年轻化的趋势。前列腺癌发病率在欧美等发达国家位居所有肿瘤第一位，死亡率居第二位，仅次于肺癌[1]。我国前列腺癌的发病率低于欧美，但最近几年呈现上升趋势。前列腺癌的危险因素包括：肥胖、高龄、遗传因素[2]。激素敏感型前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer，HSPC)、去势抵抗型前列腺癌(castration resistance to prostate cancer,CRPC)、转移性去势抵抗型前列腺癌(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)为前列腺癌发展的三部曲。早期前列腺癌主要治疗手段包括手术切除、根治性放射疗法等，但当发生转移，则主要采用雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)和化疗。在大多数情况下，HSPC会在1～3年内对ADT治疗产生耐受性，发展成为CRPC，再进一步发展可发生侵袭转移。CRPC可以在ADT下继续增殖，而mCRPC更是提示患者预后不佳，给临床治疗带来了巨大的挑战[3]。CRPC的形成可能与雄激素受体(androgen receptor, AR)的扩增、突变、敏感性增加、来自肿瘤微环境中雄激素及类生长因子的活化有关；长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)是核苷酸数超过200nt、缺少开放阅读编码框的一类RNA,包括正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因间lncRNA以及基因内lncRNA等，其中，近年研究显示，lncRNA中的HOX转录反义RNA可能在CRPC的形成以及PCa的侵袭以及转移中扮演重要角色。

1 HOTAIR概述

HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一个被发现具有反式转录调控作用的lncRNA，HOTAIR基因包含 6 232 bp，位于12号染色体的同源框C(HOXC)基因簇内并编码2.2 kb lncRNA分子，借助Suz-12蛋白从12号染色体穿梭到2号染色体，从而对2号染色体的基因产生影响[4]。HOTAIR可作为模式支架为至少两种不同的组蛋白修饰复合体提供结合面，来选择性地聚集相关的组蛋白修饰酶，从而确定靶基因组蛋白的修饰模式。研究显示，HOTAIR同时促进与多硫疏蛋白抑制复合体 (polycomb repressive complex 2，PRC2) 和组蛋白赖氨酸去甲基化酶(lysinespecific demethylase1，LSD1) 结合，上调组蛋白H3K27甲基化水平，封闭染色体，进而沉默基因表达[5]。Rinn团队证实，HOTAIR是PRC2沉默HOXD基因座的必需条件[6]。

目前表明，HOTAIR参与多个恶性肿瘤的致病过程。首先，HOTAIR 在多种肿瘤中表达上调，且与疾病不良预后密切相关。Gupta et al[7]发现在乳腺癌的原发灶和转移灶组织标本中 HOTAIR 表达均升高；Yang et al[8]的研究发现 HOTAIR 的高表达与肝癌的转移和复发以及肝癌细胞的耐药性密切相关；Kogo et al[9]的研究也证实高表达HOTAIR的结肠癌细胞增殖能力增强。此外，在胃肠道肿瘤[10]、胰腺癌[11]、喉癌[12]、鼻咽癌[13]及肺癌[14]等恶性肿瘤中，也显示HOTAIR 的表达水平与上述恶性肿瘤的临床分期以及淋巴转移等有明显的关联，多组数据表明HOTAIR高表达的患者预后不佳。这提示 HOTAIR高表达可能在各类肿瘤的发生、转移侵袭中扮演重要角色，HOTAIR可以作为一个新的肿瘤预后分子标记。

研究[15]表明，HOTAIR与PRC2的结合，可增加Wnt/β-catenin信号通路的关键抑制因子WIF-1启动子区域H3K27的甲基化程度，沉默WIF-1基因，从而激活Wnt/β-catenin通路，引起细胞核内转录因子β-catenin积聚，进而调控VEGF、MMP-7、cyclinD1等下游基因的表达，诱导肿瘤血管形成、促进肿瘤侵袭与迁移以及发生生长抑制逃逸。Li et al[12]发现，HOTAIR通过增加 ATK 通路上游的抑癌基因PTEN 启动子的甲基化率，沉默PTEN基因的表达，引起Akt 通路的活化，使得Akt下游的MMP-9等基因表达上调，BAX、FOXO1 等基因表达下调，从而促进肿瘤侵袭与转移并减少细胞凋亡；此外，活化的Akt蛋白可抑制p53蛋白活性，进而促进Bcl-2表达、抑制Bax表达，抵抗肿瘤细胞凋亡；HOTAIR也可以通过Akt及p53上调VEGF等促血管生成因子并下调TGF-β等抗血管生成因子的表达来诱导肿瘤的血管生成[16]。活化的Akt还可以下调p21的表达，解除p21 对一系列Cyclin-CDK复合物活性的抑制，增加Rb蛋白的磷酸化，进而增加E2F 转录因子活性，使细胞通过G1期，促进肿瘤细胞的增殖[17]。综上，HOTAIR与PRC2的结合，会同时促进肿瘤细胞中组蛋白H3K27三甲基化(histone H3 tri-methylated at lysine 27，H3K27me3)形成，从而影响WIF1、PTEN、p21等基因的表达，并通过这些基因调控Wnt、Akt及p53等信号通路，从而在肿瘤的细胞周期、凋亡、血管生成、侵袭与转移等过程中发挥重要功能。最近研究[18]显示，HOTAIR在CRPC中表达上调，并和CRPC的AR再活化关系密切，这提示HOTAIR可能在CRPC发生发展中起着至关重要的作用。

2 HOTAIR与PCa的关系

2.1HOTAIR促进PCa增殖、侵袭与转移使用小干扰RNA敲除HOTAIR后，与对照组相比，细胞增殖受到显著抑制；细胞凋亡检测表明敲除HOTAIR可以显著诱导细胞凋亡；细胞周期测定显示，在敲除HOTAIR后，停滞在G2/M期或者S期等细胞周期的细胞数量显著增加。HOTAIR在晚期转移性PCa中高表达，当敲除HOTAIR后，前列腺癌细胞的增殖受到抑制，并发生凋亡，这提示HOTAIR在PCa细胞增殖起着重要的作用[19]。

除此之外，研究还表明，HOTAIR还可以促进PCa的转移与侵袭。前列腺癌微环境中的免疫细胞会影响PCa的进展，其相关机制可能涉及HOTAIR信号通路。前列腺癌细胞比正常前列腺上皮细胞更容易招募肥大细胞浸润，ADT治疗后的前列腺癌招募效果更甚，浸润的肥大细胞可以增加前列腺癌的转移和侵袭。研究[20]显示，侵袭阶段PCa中的lncRNA-HOTAIR与PRC2复合物结合增加；在敲低PCa中AR基因的表达后，CD133+干/祖细胞群增加，这表明PCa中CD133+干/祖细胞群增加可能与AR表达下调有关；此外，在AR低表达后，PCa中的基质金属蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase 9，MMP9)表达上调。由于MMP9是与PCa转移相关的基因，干/祖细胞具有较高的侵袭能力[21]，两者均可导致PCa细胞侵袭与转移能力的增强。总的来说，在招募肥大细胞的浸润后，PCa的LncRNA-HOTAIR与AR基因5'启动子区域结合，进而对PRC2复合物实施调节，从而减少AR转录。在AR转录受到抑制后，PCa中的MMP9表达增加和(或)CD133+干/祖细胞群数量增加，从而增强PCa细胞的侵袭与转移能力。在这个过程，LncRNA-HOTAIR起着至关重要的作用。这些新发现提示，将来或许可以通过靶向抑制LncRNA-HOTAIR表达的方法，实现对PCa的有效治疗。

2.2HOTAIR促进CRPC进展HSPC、CRPC、mCRPC为前列腺癌发展三部曲，CRPC可以不依赖雄激素而继续增殖，给临床治疗带来了巨大的挑战。近期研究[22]表明，HOTAIR与CRPC进展具有密切相关性。在雄激素剥夺的PCa细胞中进行细胞增殖测定，结果显示HOTAIR过度表达确实能够增加在雄激素缺乏环境下的PCa细胞的增殖，而敲低HOTAIR表达则消除了雄激素非依赖的细胞增殖。临床上，抗雄激素药物早期可以显著降低PSA的水平，但随着治疗时间的延长，在治疗后期，PSA会逐渐上升。更为重要的发现是，在进行抗雄激素药物治疗后，前列腺癌细胞中的HOTAIR表达会逐渐增加。这些研究结果表明，HOTAIR表达上调可能至少部分地解释抗雄治疗失败的原因，包括恩杂鲁胺(enzalutamide)耐药的产生，提示HOTAIR过表达或许可以促进CRPC的进展，为临床治疗CRPC提供新的思路。

3 HOTAIR与雄激素受体(AR)的关系研究

雄激素信号通路在PCa的发生、去势抵抗以及侵袭迁移中起着重要的作用，近年来的研究显示HOTAIR与前列腺癌的去势抵抗以及侵袭迁移密切相关，明确HOTAIR与雄激素受体的关系，弄清去势抵抗环境中雄激素受体(AR)活化的机制，有助于从分子水平理解PCa的去势抵抗以及侵袭迁移的形成机制，从而为治疗CRPC提供新的分子靶点，推动CRPC治疗药物的实验研究和临床应用。

3.1生理条件下雄激素抑制HOTAIR的表达已知AR能够通过染色质环的介导作用实现与增强子的强结合以及与启动子的弱结合来调节靶基因[22]。通过染色质免疫沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq)显示，在HOTAIR基因上游46 kb和下游的66 kb与137 kb分别有三个强AR结合位点。同时模体统计分析显示，HOTAIR启动子上有三个雄激素反应元件(androgen response element,ARE)，实验[22]表明，AR也可以与HOTAIR启动子结合。在ChIP-qPCR比较实验中，雄激素可显著促进AR与HOTAIR启动子的结合。说明AR能够与HOTAIR的增强子以及启动子结合，并且这种结合受到雄激素的正向调控。

进一步通过HOTAIR部分缺失的探针实验显示，HOTAIR前360 bp的区域与AR蛋白的结合有关[22]；RNA pull down等实验表明AR的N-末端域(N-terminal domain, NTD)直接作用于HOTAIR lncRNA的5’末端，而与AR的DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)以及配体结合域(ligand-binding domain, LBD)无关[22]。RNA聚合酶IIChIP-qPCR显示，HOTAIR和几种已知可以被AR抑制的基因的RNA聚合酶Ⅱ占据率下降，但在AR激活的基因如PSA和KLK2的RNA聚合酶Ⅱ占据率上升，这说明HOTAIR在转录水平受到雄激素的抑制作用；随后的qRT-PCR分析显示,LNCaP细胞系中HOTAIR的表达对雄激素高度敏感并且受到雄激素的显著抑制。在其他的前列腺癌细胞系中，细胞接受了雄激素治疗后也出现了相似的HOTAIR表达受限的结果。而敲除LNCaP细胞系中的AR基因后，HOTAIR的表达恢复；通过RNA衰变测定显示乙醇和雄激素处理的细胞中的HOTAIR降解的速率没有显著差异，排除了雄激素通过影响RNA稳定性从而抑制HOTAIR的作用机制。因此HOAIR是一个在转录水平受到雄激素抑制的lncRNA，这种抑制作用通过AR介导。

3.2CRPC中HOTAIR辅助ADT后雄激素轴的再活化

3.2.1HOTAIR在CRPC中表达升高 生理情况下，细胞中的HOTAIR表达会被雄激素所抑制。然而，在对PCa患者进行去势治疗后，由于体内雄激素水平的下降，HOTAIR的抑制被解除，表达显著升高。通过对PCa细胞系进行qRT-PCR分析，可以观察到HOTAIR在CRPC细胞系模型如LNCaP-abl和C4-2B中急剧上调；重新分析了两个公开可用的数据集，结果显示与局限性PCa相比，HOTAIR在转移性CRPC中显著上调；同时，根据生化复发将局部PCa分为两组，结果显示HOTAIR在复发性PCa患者中显著上调；在PCa组织微阵列中进行了RNA原位杂交后，表明HOTAIR表达在复发性PCa中的确明显强于非复发性PCa[22]。

3.2.2HOTAIR可以稳定AR蛋白并延缓AR降解 当细胞系中的HOTAIR过表达后，AR蛋白水平也显著增加，但翻译AR蛋白的mRNA却并没有增加；将细胞中的HOTAIR基因敲除后，AR蛋白降解加速，这说明HOTAIR与AR蛋白的稳定性相关。MDM2是一种E3连接酶，通过作用于AR的N-末端域，导致AR蛋白泛素化，进而被降解[23]。实验证实，HOTAIR的5’端与AR蛋白的N-末端域结合，从而阻断E3连接酶MDM2与AR的相互作用，抑制了AR蛋白的泛素化和降解，从而稳定了AR蛋白。雄激素诱导的配体结合也有稳定AR蛋白的作用[24]。

3.2.3HOTAIR增强AR的转录活性 提取细胞核中游离以及与染色质结合的蛋白质组分，进行蛋白质印迹分析，结果显示HOTAIR的表达显著增加细胞核中AR的含量，并促进了AR与染色质上雄激素结合位点(AR-binding site，ARBS)的结合。使用位点特异性引物在几种已知的AR靶基因上进行AR ChIP-qPCR，结果显示HOTAIR过表达能增加PSA、TMPRSS2、FKBP5、OPRK1和MET等AR诱导基因的增强子AR的招募[25]；与AR诱导基因增强子招募AR增加一致，qRT-PCR也证明了HOTAIR可以增加AR诱导基因的表达，而降低AR抑制基因的表达；此外，RNA干扰敲除AR可以完全消除HOTAIR诱导的AR靶基因的表达。这些结果表明HOTAIR可以促进AR-染色质的结合并增强AR的转录活性。

3.2.4HOTAIR驱动雄激素非依赖性的AR染色体定位 蛋白质印迹分析显示，即使在缺乏雄激素的情况下，HOTAIR的表达仍能显著增加LNCaP细胞核中的AR含量；基因组浏览器视图证实，HOTAIR的过表达促进TMPRSS2、FKBP5、PSA和KLK2等AR靶基因的增强子处AR的结合； 此外，ChIP-qPCR也证实，即使是在缺少雄激素的条件下，HOTAIR的过表达也能明显促进AR蛋白与靶基因的结合。最重要的是，在C4-2B细胞中进行HOTAIR敲除后，AR与靶基因结合的数量极大减少，这表明HOTAIR是CRPC细胞中雄激素非依赖性AR活化的必需条件[22]。综上所述，HOTAIR的表达在诱导和维持雄激素非依赖性AR的活化以及AR在染色体定位中起决定性作用，这从分子机制上增加了人们对CRPC形成的认识，明晰了人们对HOTAIR与雄激素非依赖性AR的活化以及CRPC形成这三者之间的关系，为临床有效改善CRPC的治疗提供新的思路和手段。

3.2.5HOTAIR在ADT下诱导启动AR的转录程序 70%HOTAIR介导的AR结合位点与雄激素介导的AR结合位点重叠，这支持HOTAIR不是重编程AR而是主要增加AR活性。AR ChIP-seq的热图分析结果证实，在ADT条件下，HOTAIR过表达诱导的AR结合谱与雄激素刺激的AR结合谱极为相似；并且HOTAIR与雄激素在介导AR与染色体结合最大化上显示出协同作用；此外，Treeview热图分析表明，大部分HOTAIR诱导基因也同时受雄激素诱导，而HOTAIR抑制基因也受雄激素抑制；基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)以及qRT-PCR均证实，雄激素诱导基因受HOTAIR诱导表达显著上调，而雄激素抑制基因则受HOTAIR抑制表达下调[22]；ChIP-qPCR 分析也显示，敲除HOTAIR阻断了雄激素介导的AR活化；实时荧光定量PCR检测同样显示，敲除HOTAIR抑制了AR转录活性，这都说明HOTAIR是在ADT下AR与靶基因结合的必需条件。

总的来说，生理条件下的雄激素可以抑制HOTAIR基因的表达；当在低雄激素环境中，如在ADT下，随着雄激素抑制作用的解除，HOTAIR基因会过表达，活化的HOTAIR可稳定AR蛋白，延缓AR降解，增强AR的转录活性，促进AR的活化，从而在ADT环境下促进CRPC的形成、进展。

4 展望

在ADT后，HOTAIR在PCa中高表达，并增强PCa的侵袭与转移以及促进CRPC形成，因此HOTAIR或许可以成为预测CRPC形成的有效指标[26-27]，早期监测PCa中的HOTAIR表达水平，可能可以及早发现CRPC形成的趋势，并及早进行临床干预，阻断CRPC的形成。不过，在早期发现CRPC形成的趋势后，如何有效阻断CRPC的形成仍是一个亟需解决的难题，这需要更进一步的研究和探索。无论如何，这给临床医师以及研究者提供一个新的思路：或许可以通过早期监测PCa中的HOTAIR表达水平，早期预测干预以阻断CRPC的形成，而不是等到CRPC已经形成后。此外，HOTAIR是低雄性激素环境下AR再活化的主要驱动因素，可以促进AR与靶基因的结合，增强AR的转录活性，从而导致PCa可以不依赖雄性激素而继续增殖，促进CRPC的形成。这加深了人们对CRPC形成分子机制的认识，为临床治疗CRPC提供新的分子靶点，推动相关药物的研究，从而为改善目前CRPC的治疗现况带来新的希望。HOTAIR还促进PCa的侵袭与转移，HOTAIR也可能成为延缓甚至阻止PCa侵袭迁移的新靶点。