鲤疱疹病毒2型研究进展

袁锐，陈静，刘训猛，吴亚锋，王晶晶，方苹

（江苏省水生动物疫病预防控制中心，江苏 南京 210036）

鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，Cy-HV-2）是一种引起金鱼和鲫Carassius auratush造血器官坏死病的高致病性病毒，严重危害金鱼、鲫养殖业。该病毒自1992年在日本首次发现后[1]，迅速蔓延至亚洲、北美洲、大洋洲、欧洲，在我国鲫主养区大规模暴发流行。仅2012年就导致江苏异育银鲫发病面积约3万hm2，发病区域死亡率在50%以上，严重地区达90%，部分养殖池塘绝收，造成严重的经济损失。本文简要综述了1992年CyHV-2首次发现以来的相关研究进展，为CyHV-2的深入研究及有效防控策略提供参考。

1 病原学

1.1 病毒的分类及命名

该病毒最初在日本养殖的患造血器官坏死病、引起爆发性死亡的金鱼体内发现。当时该病毒被命名为金鱼造血器官坏死症病毒[1]。该病毒是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，将该病毒命名为鲤疱疹病毒 2型（CyHV-2），与鲤痘疮病毒（CyHV-1）、锦鲤疱疹病毒（CyHV-3）[2-4]同属于疱疹病毒目、异样疱疹病毒科、鲤科疱疹病毒属，是我国危害极大的鲫造血器官坏死病的病原[5,6]。

1.2 病毒的特点

扫描电镜观察发现，CyHV-2的核衣壳呈六角形或球形，直径大约115～117 nm；有囊膜的完整病毒粒子呈椭圆形，直径170～220 nm[7]。病毒对碘脱氧尿苷（IUdR）、酸度和乙醚都比较敏感：在浓度10.4 mol/L IUdR和pH3时，病毒不能复制；pH11时，实验组病毒培养液的滴度与控制组相近；乙醚能够影响病毒对宿主细胞的侵染能力，在乙醚存在情况下，病毒失去了对FHM细胞的感染力[1]。

1.3 基因信息

CyHV-2与同属鲤科疱疹病毒属的CyHV-1和CyHV-3一样，均为双链DNA病毒，其基因全长约为290 kbp，G基因和C基因所占比例为51.7%。基因组共编码154个开放阅读框（Open reading frame），其中有4个末端重复序列，整个基因组还有两个无编码功能的碎片基因[8]。

目前对CyHV-2的基因分型的报道较少。GenBank收录的CyHV-2序列共有36条，包括从日本患病金鱼中分离到的毒株，如DNA聚合酶基因、解旋酶基因、衣壳体间三联蛋白基因等部分或完整基因，还有一些从美国的患病金鱼分离的毒株，主要是CyHV-2 DNA聚合酶基因，亦有从我国患病鲫体内甚至是洱海等环境中分离得到的毒株序列，如部分解旋酶基因等，其中提交的一个CyHV-2全基因序列是一种新的基因型。

李莉娟等[8]对从国内患病鲫体内分离的毒株（SY-C1）进行了全基因测序，并与日本株（ST-J1）进行了全面的比较分析。结果表明，尽管两个毒株的序列具有98.8%的相似性，但是，SY-C1株型的单核苷酸突变、插入、缺失和重排等与ST-J1株存在明显的变异，尤其是SY-C1株型在基因组的第32313个核苷酸位置上有一个523个核苷酸片段的缺失，这也是两个毒株基因组的最显著差异，TK（胸苷激酶）基因的明显差异也可以用来区别两种株型。因此，李莉娟等[8]认为SY-C1明显区别于ST-J1，是一株全新的CyHV-2基因型。目前除了这两种株型外，世界范围内关于其他CyHV-2基因分型的报道还比较少，国内目前分离的CyHV-2毒株都与SY-C1型有极高的同源性。

Davision等[9]应用先进的生物信息技术对三种鲤科疱疹病毒能够编码的蛋白进行预测分析。结果显示，CyHV-2基因组含有约150个编码功能蛋白的开放阅读框（ORFs），包含一些在三种鲤科疱疹病毒基因组内共有的保守ORFs：如ORF33编码DNA包装末端酶亚基；ORF71编码DNA解旋酶亚基；ORF72编码病毒衣壳三联体亚基；ORF78编码衣壳成熟蛋白酶；ORF79编码DNA聚合酶亚基等。其余的CyHV-2 ORFs中只有少数的功能得到确认，如ORF25、ORF25C和ORF25D能够编码膜蛋白[10]；ORF104编码类激酶蛋白[11]，该蛋白在病毒感染鱼体过程中起重要的作用。其他的ORF功能还有待进一步的研究。

2 流行病学

2.1 历史和全球分布

1992年秋季和1993年春季日本爱知县和奈良县养殖的金鱼连续爆发以CyHV-2为病原的病毒性疾病，死亡率近100%[1]。之后，CyHV-2迅速蔓延至全球多个国家和地区，遍布亚洲、北美、欧洲、大洋洲。据不完全统计，已有超过十一个国家和地区爆发该疾病（表1）。自2012年CyHV-2在我国江苏北部鲫主养区发现后，一直呈现蔓延趋势，目前，江苏、北京、武汉、广州等地养殖异育银鲫体内均检出CyHV-2[23,24]。除养殖鲫外，湖北洪湖、安徽巢湖的野生鲫也不同程度携带CyHV-2[25]，说明该病在我国已广泛存在。

表1 CyHV-2全球的流行情况（不完全统计）Tab.1 The global prevalence of CyHV-2（incomplete statistics）

2.2 病毒宿主

2011年以前报道的CyHV-2感染病例均发生在金鱼体内，而Andor等[17]在匈牙利患病鲫体内检测到了CyHV-2，这是CyHV-2感染鲫的首次报道。随后，中国、捷克等国[3,18,19]的患病鲫相继检测到了CyHV-2。迄今，已报道的CyHV-2的致病宿主包括金鱼、鲫及其普通变种，尚无其他鱼类及物种感染CyHV-2发病的报道。

Jung等[1]用腹腔注射研究锦鲤Cyprinus carpio感染CyHV-2的情况。结果表明，被注射的锦鲤既没有死亡发生，也没有病理变化，即CyHV-2不会感染锦鲤。Jeffrey等[16]将与金鱼种系相近的鱼类如鲤Cyprinus carpio、雅罗鱼Leuciscus、丁鲷Tincatinca等和发病金鱼在同一养殖系统里长期共养，结果这些鱼均未被感染发病，即使在适宜温度下也未发生感染。王璐[26]用CyHV-2感染罗非鱼Oreochromis spp、团头鲂 Megalobrama amblycephala、建鲤 Cyprinus carpiovar Jian、金鱼、江都银鲫（父本）和日本白鲫Carassius auratus cuvieri Temminck et Schlegel（母本）杂交一代、鲤（父本）和异育银鲫（母本）杂交一代，研究CyHV-2感染宿主的范围，结果发现，江都银鲫（父本）和日本白鲫（母本）杂交一代、鲤（父本）和异育银鲫（母本）杂交一代均对CyHV-2敏感，而罗非鱼、团头鲂、建鲤则无发病死亡现象。Ito等[27]的研究则证实，日本鲤亚科的鱼类对CyHV-2的敏感性低于金鱼，CyHV-2在各种鲫体内的繁殖能力可能不同。徐跑等[28]研究表明，鲫鳃出血病主要危害池塘养殖中的异育银鲫，而同池混养的鲢Hypophthalmichthys molitrix、鳙 Aristichthys nobilis、草鱼Ctenopharyngodonidellus、鳊Parabramispekinensis等均未发病，在鳃出血病症严重发生的池塘中，混养的鲢、鳙、草鱼、鳊均未感染CyHV-2，而在患病的异育银鲫中检测到了CyHV-2。这些研究表明，虽然CyHV-2具有较高的传染性，但感染谱较小，仅感染金鱼、鲫及其普通变种。

2.3 流行季节和传播方式

CyHV-2是一种高度感染、高致死率的病毒，感染鱼出现症状后24～48h即死亡。其感染的异育银鲫鳃出血病主要发生在春秋两季，流行温度范围广，从10～33℃均可发生，以15～27℃最为严重。水温27℃以上时，发病死亡逐步减少，超过32℃时，没有鲫死亡，然而夏季过后，水温降低至25℃以下时，该病害又开始发生，直到水温降到15℃以下时，病害才逐渐停止[18,24,28,29]。

推测CyHV-2的传播途径主要有垂直传播和水平传播两种。1995年，台湾金鱼幼鱼爆发造血器官坏死病，Chang等[12]根据发病史推测，病原来自引进的金鱼亲本上。这是CyHV-2垂直传播的首次报道。Goodwin等[30]在感染CyHV-2的亲鱼卵和幼苗中检测到了该病毒，进一步为病毒的垂直传播提供了证据。Ding等[31]根据组织病理学推测，CyHV-2经鳃进入鱼体，在鳃组织内繁殖，诱导鳃组织的上皮细胞脱落和坏死，将病毒释放到水体中而传染。Minamoto等[32]应用实时荧光定量PCR技术在中国云南洱海和滇池两个自然湖泊水域检测到了Cy-HV-2，最大浓度达1.3×105copies/L，证实了Cy-HV-2水传播的可能性。

2.4 临床症状和病理特征

感染CyHV-2的金鱼和鲫主要临床症状为行动迟缓，停留于养殖池底部[2]，厌食、呼吸频率增加[7]，眼球突出、腹部膨大[16]，肛门红肿、偶见体表和鳍基部出血[20]。解剖发现，病鱼鳃和肝胰脏苍白，有腹水，脾肿大，脾肾表面伴有白色斑块或结节，肠道无食[2]，肾和鳔点状出血[33]。

组织病理观察显示，患病金鱼的主要病理变化发生鳃、脾、肾：初级和次级鳃小片融合，前肾和后肾呈弥漫性坏死，脾脏多病灶部位坏死，在坏死区域可见明显的核固缩和染色质边缘的核增大[33]。

林秀秀等[34]对患病异育银鲫不同组织的病理观察发现，头肾和脾脏细胞溶解、免疫系统和造血系统受到严重破坏；中肾小球萎缩、肾小管上皮细胞脱落、肾间质出现空泡、免疫细胞侵润；肠道绒毛增生、绒毛和微绒毛长度显著减少、粘膜下层显著增厚；肝胰脏中肝细胞溶解、中央静脉受损；鳃中毛细血管破坏、血管破裂或扩大、红细胞溢出、鳃小片基部细胞显著减少。

方进等[35]用PCR、光镜和透射电镜分析了患病鲫的组织病变及病毒分布。对已知鲤科疱疹病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因的PCR扩增可确定，CyHV-2存在于被感染鱼的肝胰脏、脾、肾和头肾组织中。对不同时序组织病理变化的比较表明，CyHV-2感染引起鲫不同程度病变，而鳃和头肾的病理变化有显著的时序相关性。在头肾细胞中还观察到大量Cy-HV-2颗粒，预示鲫头肾是CyHV-2侵染和复制的主要靶器官。

有报道也显示，感染CyHV-2的银鲫其他部位有明显的炎症反应，并伴随有溶血、细胞核增大、核碎裂、上皮细胞脱落、空泡变性、病灶坏死等病理特征[18,31]，最显著的病理变化在鳃、脾和肾组织中。Ding等[31]对组织坏死程度进行了半定量的评估。结果显示，感染的肾、脾、肝、鳃与健康的相比，有显著的变化，尤以肾组织的病理变化最为明显。

2.5 潜伏感染

疱疹病毒的特点之一是在初次感染后具有潜伏宿主的能力，即病毒在宿主内存留遗传物质但不复制病毒颗粒，基因不表达或仅有少数潜伏相关基因表达；在一定的应激条件下，如改变温度等，潜伏的病毒可被诱导复制，释放病毒粒子，导致宿主出现疾病的临床症状。

鲤疱疹病毒2型也存在潜伏感染。对18个渔场中的健康金鱼、怀卵鱼、鱼卵、鱼苗和病鱼等进行了定量PCR检测，在14个场的健康鱼中检出Cy-HV-2阳性；118个养殖池的怀卵鱼样品中有42个检出阳性，许多鱼苗中也检出CyHV-2[30]。而对这些携带病毒的健康鱼进行10～22℃的温度刺激时，病毒的DNA拷贝数明显的增长，即当水温合适时，携带病毒的健康鱼将伴随病毒的大量增殖而发病。

3 诊断与检测

3.1 细胞培养分离

细胞分离培养技术是鱼类病毒病最准确的诊断方法之一，关键是已建立的细胞系。目前可用于分离CyHV-2的敏感细胞系有：锦鲤鳍细胞系（koi-fin cell lines,KF-1）[1]、金鱼鳍细胞系（goldfish fin cell lines，GFF）[36]等。但是，这两种细胞系在分离CyHV-2的过程中还存在一些问题，如锦鲤鳍细胞系只能传代5次，超过5次的传代，CyHV-2就不敏感；金鱼鳍细胞系虽然不存在随传代次数的增多，敏感性降低的问题，但是其获得的病毒滴度始终较低（102.0TCID50/mL）。其他常见的细胞系如草鱼性腺细胞系（ovary cells of grass carp，CO）、鲤上皮瘤细胞系（epithelioma papulosum cyprinid，EPC） 和胖头Pimephales promelas肌肉细胞系（muscle cells of fathead minnow，FHM）均对CyHV-2不敏感，不能有效分离该病毒。近来，建立一种新的细胞系（鲫脑细胞系，GiCB）[37]，可用于该病毒的分离、传代，可有效传代达50次以上，病毒滴度可达107.5±0.37TCID50/mL。当然，细胞一次传代通常需要一周，影响疾病诊断的时效性，对于病原的快速确诊，细胞分离培养还不是最好的选择。

3.2 分子生物学检测技术

目前诊断CyHV-2病原的最有效和普遍采用的方法是PCR扩增技术，包括普通PCR技术、双重PCR检测技术、巢式PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术和LAMP检测技术等。Waltzek等[4]基于CyHV-2的解旋酶基因建立了常规PCR。该方法具有较高的特异性和敏感性，对CyHV-1、CyHV-3和IcHV-1基因组DNA无扩增。针对构建的质粒和患病金鱼肾脾组织DNA抽提液的分析灵敏度分别78copies和84 copies/μg DNA，能有效检测不同地区（日本、加州、俄亥俄州和宾夕法尼亚州）的Cy-HV-2分离株。徐进等[24]亦针对CyHV-2的解旋酶基因建立了巢式PCR检测方法，并成功鉴定了一株CyHV-2病毒，命名为鲤疱疹病毒2型武汉株（Cy-HV-2-WH）。以鲤科疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因为目的基因建立的普通PCR可以有效检出病原[16,18]，从病鱼的鳃、肾、脾等组织提取的核酸可被PCR扩增出362bp特异性产物。罗丹等[38]利用Cy-HV-2三联体蛋白基因的两段保守序列设计特异性引物，通过多次的PCR体系优化，建立了稳定的CyHV-2双重PCR检测技术，为检测鲫体内的Cy-HV-2提供了新的检测手段。

随着检测要求的不断提高，PCR检测技术不断优化以提高灵敏度和特异性等。其中，Goodwin等[39]基于该病毒的聚合酶基因设计引物和探针，建立了实时定量Taqman PCR方法。该方法能够更为灵敏地检测到CyHV-2，灵敏度达到了1个病毒基因拷贝数。该方法不仅能从具临床症状的鱼中检出Cy-HV-2，还能检测诊断看似健康的1龄鱼种，甚至3～5龄的亲鱼。近年来CyHV-2导致的疫情频频发生，对养殖业造成严重经济损失，日韩等国家也要求我国出口的金鱼、鲫出具CyHV-2的检疫证书，因此国内一些检验检疫机构也纷纷建立快速敏感的实时荧光PCR方法。如徐晔等[40]设计的荧光定量检测方法的灵敏度为5copies/μL，远高于普通PCR的 5×102copies/μL；于力[41]选取 CyHV-2 序列基因的保守区域MCP基因ORF92设计引物，亦建立了灵敏度高、特异性和重复性好的荧光定量PCR检测方法。该方法不仅应用于鱼体病原的检测，Minamoto等[32]还利用该检测方法在中国云南的洱海和滇池自然湖泊成功检测到了CyHV-2。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种近年来广泛应用于细菌、病毒等病原体的新式恒温核酸扩增技术，比传统的PCR技术时间较短，适合现场诊断；特异性强，灵敏度高，不需要特殊的仪器设备，具有良好的应用前景。He等[42]基于CyHV-2末端酶基因设计引物，首次建立了可以快速检测CyHV-2的LAMP方法，整个扩增过程只需30min，结果更加直观；与28个其他常见鱼类病毒病或细菌病的检测无交叉污染。随后又相继有针对不同的目的基因（衣壳体三联蛋白[43]、解旋酶基因[44,45]）的快速检测CyHV-2的LAMP方法。结果均证明，LAMP检测的灵敏度明显高于常规PCR方法，达到了荧光定量PCR检测的灵敏度，在产物中加入SYBR Green I，根据其颜色变化来判定结果，使得结果更加直观，所需时间更短，具有应用空间。

3.3 其他检测技术

除了以上常用检测技术外，研究人员还在尝试其他一些更快速，更准确检测CyHV-2的手段。郝中香等[46]根据CyHV-2ORF6基因序列设计并合成ORF6基因特异性引物及TaqMan探针，建立了检测Cy-HV-2的微滴式数字PCR（ddPCR）方法。其检测灵敏度甚至比QPCR还要高5倍，更灵敏，特异性更强，能快速检测极低含量的病毒，可精确、可靠检测Cy-HV-2，以满足CyHV-2特性研究和感染诊断的需要。

免疫学诊断技术是一种稳定性极强的诊断方法，广泛应用于各类病毒检测。孔善云等[47,48]应用CyHV-2编码的ORF72基因所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒鱼体中的相应抗体，首次建立了针对CyHV-2的免疫学诊断方法。该方法用纯化的衣壳72蛋白为检测抗原，鲫血清作一抗，免抗鲫IgM多克隆抗体作为二抗，酶表羊抗兔作为三抗鉴定鲫是否存在CyHV-2特异性抗体，可有效确诊鲫是否感染CyHV-2，为商品化免疫学检测技术奠定了基础。

其他检测技术也广泛应用于CyHV-2的检测，如电镜观察[18]、原位杂交技术[31]等。检测方法的多样性为有效开展疾病防控提供了广阔的思路。

4 防控措施

4.1 苗种检疫

苗种检疫可以有效预防各类水生动物疾病。鲤疱疹病毒2型存在潜伏感染，成鱼、鱼苗、鱼卵均可感染[30]，及时对引进的苗种进行病毒检测，可有效预防苗种带毒，从源头控制病毒的感染与传播。

4.2 免疫增强剂

目前还缺乏有效治疗鱼类病毒病的药物，在饲料中添加免疫增强剂以提高鱼体免疫力，不失为一种有效的预防措施。陈昌福等[49,50]在饲料中拌入酵母多糖，在疾病流行高峰前连续投喂28d，刺激了异育银鲫的几种免疫相关物质的活性，降低了鱼的感染率，显著提高了成活率。

4.3 改善养殖模式

疾病的发生与发展往往与养殖模式密切相关。长期的单一品种养殖模式的优点是比较适合生产管理、种苗的选购、饲料的使用、成鱼的销售等日常管理都方便，易形成产业服务链，但长期单养破坏了养殖水域的生物多样性，病原间的制约关系较为薄弱，易使病原微生物扩散转播，造成疾病的爆发流行。改单养异育银鲫为多品种混养，改善养殖环境，减少疾病风险有可能避免疾病造成的经济损失，也能在一定程度上提高养殖经济效益。

4.4 疫苗

疫苗能增强动物的免疫力，预防相关疾病的发生，减少各类药物的使用，降低养殖成本，解决各种药物残留带来的食品安全和环境污染等问题，广泛应用于水产病毒疾病防治。各类水生动物疾病的疫苗研究也普遍开展，如草鱼出血病相关疫苗[51]、嗜水气单胞菌疫苗[52]、鳗弧菌减毒活疫苗[53]、溶藻弧菌疫苗[54]、罗非鱼海豚链球菌疫苗[55]、创伤弧菌疫苗[56]等。目前已有草鱼出血病细胞灭活疫苗和嗜水气单胞菌病灭活疫苗获得国家新兽药证书的批准。

鲫疱疹病毒病的病原最先在金鱼体内发现，日本学者[57]尝试用金鱼鳍细胞系富集病毒，收集病毒悬液，用福尔马林制成灭活疫苗进行防治研究。结果表明，该方法对金鱼造血器官坏死病具有明显的防治效果。Ito和Maeno[58]收集在金鱼鳍细胞系中扩增的CyHV-2病毒上清液制备疫苗，腹腔注射，进一步研究了腹腔注射疫苗的有效期及免疫效果。结果表明，注射疫苗感染CyHV-2金鱼的存活率显著高于未注射疫苗的病鱼，免疫有效期可持续8周以上，而在首次注射疫苗4周后，再注射一次疫苗，可进一步提升免疫效果，延长免疫有效期。

自2012年我国爆发鲫疱疹病毒病以来，我国广泛开展相关疫苗研究工作。Zhou等[10]选取三种Cy-HV-2膜蛋白基因（ORF25、ORF25C、ORF25D）重组到毕氏酵母中，表达出三种重组蛋白（tORF25、tORF-25C、tORF25D）。将这三种蛋白纯化后，肌肉注射到鲫体内，其免疫保护率最高可达75%，证明该重组蛋白具备预防鲫疱疹病毒病的潜力。Zhang等[59]应用β—丙内酯制备灭活CyHV-2疫苗对鲫进行免疫试验。结果表明，受免鲫体内各项免疫活性物质含量显著上升，感染CyHV-2后的存活率达到了71.4%，具有较好的应用前景。廖红等[60]用不同浓度原核表达的CyHV-2 ORF5重组蛋白免疫异育银鲫，免疫保护率最高可达35%。

目前疫苗研究还停留在实验室阶段，离实际应用还有较远的距离。但是，疫苗作为控制病毒病的最有效手段，具有广阔的应用前景，未来有望通过灭活疫苗、减毒重组疫苗、基因工程疫苗等来达到防控CyHV-2的目的。

5 展望

由CyHV-2引起的鲫和金鱼造血器官坏死病在世界范围内不断的流行和蔓延，严重危害全球多个国家的金鱼及鲫养殖业。尽管全世界已从临床诊断、流行病学、基因组学、防控手段等对该病展开了一定程度的研究，但关于防控方面的研究还不够深入，CyHV-2仍未能得到有效控制。随着国际贸易的频繁往来，加剧了CyHV-2在世界范围内的传播，还需加强CyHV-2的致病机理、传播机制、病毒基因组、病毒宿主相互作用等基础研究，为防控Cy-HV-2提供有效的防控技术手段，遏制疾病的传播扩散；同时还需加强国际交流与合作，互相借鉴有效的防治措施，最终有效控制该疾病。