毛细管区带电泳技术研究龙血竭有效单体与核酸适配体及凝血酶之间的相互作用

李玉娟， 孙欣欣， 李盼盼， 欧婉露， 屈锋

(北京理工大学 生命学院，北京 100081)

中药龙血竭作为一种名贵中药材，是从百合科植物剑叶龙血树Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen中提取得到的红色树脂，被誉为“活血圣药”,主要分布于我国的云南省、广西省等地区. 现代研究显示龙血竭具有活血、消炎、消肿等多种药效[1-2], 其有效成分为酚类[3].以7,4′-二羟基黄酮(7,4′-dihydroxyflavanone,DHF)为代表的黄酮类；以白藜芦醇(Resveratrol,RES)为代表的茋类；还有二氢查耳酮类，如龙血素A(Loureirin A,LA)、龙血素B(Loureirin B,LB)、龙血素C(Loureirin C,LC)等. 其化学结构如图1所示. 研究发现，龙血竭可能通过影响体内的凝血系统来发挥药效[4]，但其是否直接作用于体内凝血酶以及是否作用于凝血酶上的肝素结合位点等问题目前均未见报道.

图1 LA、LB、LC、RES和DHF的化学结构Fig.1 Chemical structures of LA、LB、LC、RES and DHF

核酸适配体(aptamer,Apt)是单链的DNA或RNA分子，主要通过体外随机的核苷酸文库中筛选而获得[5-7]. 核酸适配体与靶标之间的特性，类似于抗原抗体之间的作用，但是又有很多抗体无法比拟的优势. 由于核酸适配体与靶标之间能够特异性结合，当核酸适配体与龙血竭有效成分也发生结合时，就会靶向转运龙血竭有效成分，增加龙血竭的血药浓度，从而发挥增强药效的作用. 现在已成功筛选到了两条凝血酶核酸适配体，其中一条由29个碱基(Apt29)构成，与凝血酶上的肝素结合位点高亲和性的结合，发挥抑制蛋白活性的作用[8-10].

研究药物分子与生物大分子间的相互作用对于深入阐明中药的作用机理，在体内的代谢过程以及配伍问题具有重要的意义，主要的分析技术有色谱法、光谱法、表面等离子体共振技术、毛细管电泳法等[11-14]，其中毛细管区带电泳技术(capillary zone electrophoresis,CZE)被广泛用于分析生物分子间相互作用. 目前未见有报道龙血竭有效活性分子与凝血酶及其核酸适配体之间相互作用的研究. 文中采用CZE法考察龙血竭有效单体与牛凝血酶(bovine thrombin,B-Thr)之间的相互作用，并对有效成分与核酸适配体之间的结合强弱进行研究.

1 实验材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 7100毛细管电泳仪购自美国安捷伦科技有限公司. 实验中采用的电泳分离通道是非涂层石英毛细管(内径75 μm；有效长度/总长度40/48.5 cm)购自河北鑫诺光纤有限公司.

龙血素A(LA)、龙血素B(LB)、龙血素C(LC)、7,4′-二羟基黄酮(DHF)、白藜芦醇(RES)的对照品(纯度>99.9%)，购自上海友思生物技术有限公司；29碱基凝血酶核酸适配体(Apt29)，购自上海生工生物工程有限公司；牛凝血酶(B-Thr)，购自美国Sigma公司；实验用水为超纯水.

1.2 溶液配制

1.2.1对照品储备液

分别称取LA、LB、LC、DHF、RES对照品适量，配制成质量浓度为1 g/L的LA、LB、LC、DHF、RES对照品储备液. 实验过程中用超纯水稀释并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.2适配体和凝血酶溶液

按照产品说明书先将Apt29离心并用规定量蒸馏水溶解配成母液，用蒸馏水配制成浓度为100 μmol/L的B-Thr母液. 实验过程中用超纯水稀释并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.3样品溶液

将龙血竭各有效单体分子分别与不同浓度的B-Thr溶液(或Apt29溶液)等体积混合，建立两者的混合孵育体系，并于25 ℃水浴中孵育30 min 后，利用毛细管电泳仪对混合液进行进样分析.

1.3 毛细管电泳条件

电泳运行缓冲液为pH8.5的Tris-HCl溶液(0.05 mol/L)，同时含10 mmol/L KCl；3.45 kPa气压进样，进样时间5 s，分离温度15 ℃，分离电压+15 kV，检测龙血竭有效单体与B-Thr相互作用时，紫外波长设为214 nm，检测与Apt29相互作用时，紫外波长设为330 nm.

1.4 结合常数计算方法

在研究化合物的相互作用过程中，通常用结合常数Kb来表示作用强弱. 特异性相互作用的Kb通过Scatchard方程[15]来计算，分子间相互作用较弱时的Kb以非特异性结合方程计算[16-17].

2 结果与讨论

2.1 龙血竭有效单体与凝血酶之间结合作用的测定

分别将一定浓度龙血竭中的5种有效活性成分(LA、LB、LC、RES、DHF)溶液与不同浓度(0～25 μmol/L)的B-Thr混合，两者如果发生结合作用，则会生成复合物，此时游离龙血竭单体成分的峰面积会降低，因此通过观察混合样品中游离龙血竭有效单体峰面积的变化，可以计算出两者的结合常数. 电泳图如图2所示.

随着两者混合体系中B-Thr浓度(1～25 μmol/L)的逐渐增加，LA峰面积逐渐降低，峰形稳定,如图2(a). 说明B-Thr在此浓度范围内，LA结合到B-Thr的活性位点上，发生了明显的相互作用. 同样考察龙血竭其余几个有效单体与B-Thr之间的相互作用. 当B-Thr浓度(5～20 μmol/L)增加时，LB的峰面积几乎不变，如图2(b). 即游离LB的浓度几乎不变，说明LB与B-Thr没有结合作用. 不断增加混合体系中B-Thr的浓度(1～10 μmol/L)，从电泳图谱中统计得到化合物LC的峰面积数据没有明显减小的趋势，如图2(c). 但是峰形出现了微弱的展宽,这些现象说明化合物LC与B-Thr之间结合作用非常微弱，推测当药物进入体内后，大部分并未结合到凝血酶的活性位点. 化合物RES的峰面积随着混合体系中B-Thr浓度的增加也没有出现下降趋势,如图2(d). 说明RES跟B-Thr混合后仍以游离态存在，并未与B-Thr发生结合作用. 当B-Thr浓度(1.0～7.5 μmol/L)增加时，DHF的峰面积没有明显变化,如图2(e). DHF的游离浓度没有明显改变，说明DHF与B-Thr没有结合作用. 通过用Scatchard方程和非特性结合方程计算得到LA和B -Thr之间的结合常数Kb为4.73×104L/mol.

图2 LA、LB、LC、RES及DHF与不同浓度(0～25 μmol/L)B-Thr孵育后化合物的毛细管电泳图Fig.2 CE chromatograms of LA、LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration B-Thr (0～25 μmol/L)

综合以上实验结果，龙血竭中的5种主要活性成分与凝血酶的结合作用过程中，同属于二氢查耳酮类的龙血素A、龙血素B、龙血素C，只有龙血素A表现出了结合作用，推测LA进入体内后会与凝血酶上的活性位点结合，发挥其药效. 其余的几种化合物仍然以游离状态存在，未结合到凝血酶分子中. 对比三者的化学结构可以看出，LB、LC分子中B环上2位和4位上取代基的类型对化合物与凝血酶的结合作用可能产生重要影响. LA分子的构象更加适应与B-Thr结合位点的嵌合. 可见，化合物苯环上取代基的类型以及所在苯环中的位置对结合起重要作用.

2.2 龙血竭有效单体与Apt29之间结合作用的测定

分别将一定浓度的龙血竭中5种主要活性成分与不同浓度(0～40 μmol/L)的Apt29溶液混合孵育后，利用毛细管区带电泳技术测定混合样品中游离龙血竭有效单体浓度,如图3所示.

图3 LA、LB、LC、RES及DHF与不同浓度(0～40 μmol/L)Apt29孵育后化合物的毛细管电泳图Fig.3 CE chromatograms of LA、 LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration Apt29 (0～40 μmol/L)

随着Apt29浓度(10～30 μmol/L)增加，电泳图中对LA峰面积进行积分，在凝血酶5个浓度梯度下游离LA峰面积几乎保持不变,如图3(a)，说明LA与Apt29之间没有发生结合作用. LB峰面积随着两者混合体系中Apt29浓度(5～40 μmol/L)依次增加而出现明显降低趋势,如图3(b)，说明LB与Apt29有结合作用. 随着体系中Apt29浓度梯度(6～30 μmol/L)依次增加，LC的峰面积没有发生明显变化,如图3(c)，说明LC与Apt29没有结合作用. 随着Apt29浓度(10～30 μmol/L)增加，RES峰面积几乎不变,如图3(d)，峰形稳定，化合物RES与Apt29之间也未发生结合现象. 在药物与核酸适配体的混合体系中，依次增加Apt29浓度(6～30 μmol/L)，DHF峰面积出现降低趋势且变成钝峰,如图3(e)，说明此浓度范围内DHF与Apt29之间产生了明显相互作用.

用Scatchard方法计算LB、DHF与Apt29之间的结合常数时,所得曲线斜率为正，同样用非特异性结合方程计算各单体与Apt29的结合常数. 龙血素B、DHF与Apt29之间的结合常数Kb分别为1.98×104L/mol和1.83×104L/mol.

龙血竭中几个化合物分子与核酸适配体之间同样也表现出了一定的结合作用，这对于揭示核酸适配体携带药物的能力提供一定参考. 比较LA、LB的化学结构，LB在苯环B环6位上增加了一个—OCH3，使LB与Apt29之间发生了结合作用，说明苯环B环6位上的—OCH3可能与Apt29上的亲电子基团发生静电结合作用. LA、LC与Apt29均没有显著的结合，说明苯环B环上4位的—OH或—OCH3取代对药物分子和Apt29之间的结合没有产生影响. DHF与Apt29之间也有结合作用，说明黄酮类的平面共轭结构也是药物分子与能形成G四链体结构的核酸(quadruplexDNA)分子结合的一个因素.

3 结 论

文中采用毛细管区带电泳法研究了龙血竭中的LA、LB、LC、RES、DHF与牛凝血酶以及29碱基凝血酶核酸适配体之间的相互作用. 结果表明，LA与牛凝血酶之间为非特异性结合，结合常数Kb为4.73×104L/mol. LB、DHF与Apt29之间是非特异性结合，结合常数分别为1.98×104L/mol和1.83×104L/mol. 这种结合作用大小或与化合物苯环上取代基团的位置、种类、数量等因素有关. 研究中药龙血竭与凝血酶及适配体之间的结合作用，有助于阐明龙血竭在体内的药效学规律，从而指导中药的合理用药发挥重要影响. 研究结果对于揭示龙血竭有效单体是否直接作用于凝血酶而发挥药效，以及凝血酶核酸适配体能否作为龙血竭的转运体以实现定向转运提供基础数据参考.