黄瓜突变体库的构建及表型变异的初步研究

薛红霞 蒋举卫 李晓丽 宋晓飞 郑金双 闫立英 孙成振

(河北科技师范学院园艺科技学院,河北 昌黎 066600)

黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科甜瓜属,原产于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区,是世界十大蔬菜作物之一,也是中国重要的经济类蔬菜作物[1]。尽管黄瓜的地理分布十分广泛,但与同科的甜瓜、南瓜等作物相比,其品种遗传基础趋向单一化,变异率仅为3%～8%[2],极大地限制了其育种进程。目前,自然突变、远缘杂交[3]、组织培养[4]、人工诱变[5]、基因工程[6]已成为种质创新的重要手段,其中以人工诱变较为常见[7]。通常,人工诱变主要包括化学诱变、物理诱变、插入诱变等技术[8]。化学诱变是指利用化学诱变剂对植物材料进行处理,诱发遗传物质核酸发生变异,主要包括核酸碱基类似物、DNA 插入剂和碱基修饰剂3类,其化合物结构具有不稳定性[9]。大量研究表明EMS 诱变具有效率高、负作用小、应用广等优势,是当前构建大规模饱和突变体库的理想诱变方法[10-12]。如Chen 等[13]基于细胞悬浮培养的高效甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)诱变体系,获得了节间变长的水稻突变体；王瑾等[14]利用EMS 溶液诱变处理抗旱性弱的小麦花药和幼胚愈伤组织,获得了13 株抗旱突变体；卢银[15]采取EMS 诱变种子1 次、EMS 诱变种子2 次及EMS 诱变花蕾结合小孢子培养的方法,构建了含有4 253 个家系及其自交M2种子的大白菜突变体库。

目前,一些作物已成功构建了饱和的突变体库,如拟南芥[16]、水稻[17]等,且明确了矮化、抗旱等基因的功能[18],而黄瓜突变体库的构建及基因功能研究起步较晚,目前大多数集中在华北型黄瓜突变体库的构建,如王晶等[19]构建了可稳定遗传的株型、叶色、花器官以及果实等丰富变异类型的长春密刺突变体库；薛存宝[20]选定1.5%和2.0% EMS 诱变黄瓜种子,获得了64 个重要表型突变家系；张兵[21]利用1%EMS 诱变处理黄瓜种子22 h,M2获得了细长果实、短粗果实、簇生叶等突变体。本研究以华南型黄瓜高代自交系6457为试验材料,通过EMS 诱变的方法构建华南型黄瓜突变体库,分析华南型黄瓜突变群体的表型变异特点,旨在拓宽黄瓜遗传背景,为黄瓜功能基因组研究和新品种选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 华南型黄瓜高代自交系6457,由河北科技师范学院黄瓜课题组提供。

1.1.2 试剂 甲基磺酸乙酯(EMS)购自北京华越洋生物科技有限公司。用于化学诱变剂溶剂配制的化学药品为常规无机试剂Na2HPO4和NaH2PO4,购自北京华越洋生物科技有限公司,产品纯度为化学纯。

取Na2HPO435.82 g、NaH2PO415.605 g,各自配置500 mL 溶液,命名为A、B 液,待试验时再按61 ∶39配制磷酸缓冲溶液,用NaOH 溶液微调pH 值至7.0[20]。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS 诱变最佳处理条件筛选 分别设置5 个EMS 浓度梯度(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、5 个时间梯度(4、6、8、10、12 h)对黄瓜6457 种子进行处理,其中对照组(CK)均放在蒸馏水中处理相应的时间。每个处理组选取50 粒大小均匀、颗粒饱满的黄瓜种子,温汤浸种3 h 后放入10 mL 离心管中,在通风橱中加入相应浓度的EMS 磷酸缓冲液,室温摇床上处理相应时间后,用1 mol·L-1Na2S2O3冲洗种子和容器1 次,倒掉,再用0.1 mol·L-1Na2S2O3冲洗3 次,流水冲洗种子2 h,然后放入28℃恒温箱催芽12 h,催芽结束后将种子播种于营养土∶蛭石为1 ∶1的基质中,统计并分析诱变后的种子发芽率、成苗率等,筛选EMS 诱变最佳处理条件[19]。

1.2.2 黄瓜突变体库的构建 2016年8月22日,将2 500 粒颗粒饱满、大小均匀的黄瓜6457 种子采用选定的最佳诱变条件进行处理,发芽后定植于河北科技师范学院实验农场。根据幼苗种植位置,进行编号。将M1植株进行单株自交授粉,并收获其种子,M1一般不进行选择淘汰。然后从每个M1种子中选取20粒颗粒饱满、大小均匀的黄瓜种子作为M2家系,进行催芽育种,待植株三叶一心时每个家系选择9 株进行定植,定植对照组20 株,最终成活的单株构成黄瓜突变体库M2群体,其他处理同常规管理。

参照李锡香等[22]的方法,以野生型黄瓜6457 为对照,对突变体库M2群体中单株的变异性状进行调查。主要调查项目为幼苗期子叶及第1 ～第3 片真叶的叶片性状,初花期的叶片、花器官、茎、株型性状,结果期的果实果形、果色等相关性状。

2 结果与分析

2.1 最佳诱变剂量的筛选

由表1 可知,随着EMS 浓度的增加及处理时间的延长,黄瓜出芽率和成苗率均呈下降趋势,表明EMS诱变可使诱变当代部分致死。当EMS 处理浓度为2.0%、时间为10 h 时,M1种子发芽率接近60%,但种子成苗率只有42%。为了保证获得较大的突变群体,同时保证一定的诱变率,最终确定1.5%EMS 处理10 h为最佳诱变处理。

用1.5%EMS 对2 500 粒饱满的黄瓜6457 种子处理10 h,共有1 666 粒种子发芽,1 204 株幼苗成活。M1幼苗定植于日光温室,自交留种。在M1群体的构建中,由于植株的育性极低,仅有221 个单株收到种子,结籽率为18.4%。在M2群体的构建中,共获得了221 个株系的1 506 个单株,仅548 个单株收到种子,结籽率为36.3%。

表1 不同诱变处理对黄瓜M1 种子出芽率和成苗率的影响Table 1 Effects of mutagenic treatments on germination and survival rate of M1 cucumber seedlings

2.2 黄瓜突变体库M1 群体性状变异

2.2.1 幼苗期叶片表型变异分析 野生型黄瓜6457子叶平展,真叶不皱缩(图1-A、B)。经过EMS 处理后,突变体黄瓜表现为发芽晚、植株矮小、真叶褶皱等性状(图1-a)。

图1 EMS 处理对黄瓜苗期表型的影响Fig.1 Effects of EMS treatment on cucumber seedling phenotype

2.2.2 全生育期植株表型变异分析 对突变体库M1群体的1 204 株黄瓜植株进行调查,共发现227 株有明显变异,主要表现为植株矮化,节间变短(图2-A),叶片小且卷曲皱缩(图2-B),畸形植株(图2-C),植株生长过程卷须较多(图2-D),植株部分叶片有杂色(图2-E),白化、黄化植株(图2-F、G),果实为嵌合体(图2-H)。通过对M1自交后代的表型鉴定,发现叶片皱缩、叶色嵌合的表型变异不能遗传,可能为EMS 化学药剂伤害造成的性状变化。

2.3 黄瓜突变体库M2 群体性状变异

由表2 可知,176 个突变单株出现38 个变异性状,总的单株变异频率为11.7%,其中在叶、花、果实、植株性状等的变异株数分别为77、32、57、10,性状变异频率分别为5.1%、2.0%、3.8%、0.8%,分别占总变异性状数的43.8%、18.2%、32.4%、5.7%。

2.3.1 M2子叶突变表型变异分析 野生型黄瓜6457 子叶平展,椭圆形,浅绿色(图3-A)。M2群体中苗期子叶主要表现为子叶黄化(图3-B)、子叶白化(图3-C)、子叶浅绿油亮(图3-D)、三子叶(图3-E)、子叶皱缩、卷曲(图3-F)、子叶畸形(图3-G)。

2.3.2 M2真叶突变表型变异分析 野生型黄瓜6457 真叶心形五角,叶缘浅锯齿,尖端尖,单叶互生,两面均有刺毛,绿色(图4-A)。M2群体中变异主要表现为幼苗期生长点黄化,真叶浅黄,植株生长过程中,变黄真叶逐渐恢复绿色(图4-B)；叶色变深且油绿,叶缘为深锯齿(图4-C、D)；叶片卷曲褶皱且内卷,叶色深绿(图4-E)；真叶表现为叶尖端锐尖,波状叶缘(图4-F、G)；真叶似心形,有深锯齿和浅锯齿之分(图4-H、Ⅰ)；叶近圆形,叶缘较平滑(图4-J)。

图2 M1 群体部分表型变异分析Fig.2 Analysis of partial mutant phenotypes in M1 plants

图3 M2 子叶突变表型Fig.3 Mutant phenotypes of cotyledon in M2 plants

2.3.3 M2花突变表型变异分析 野生型黄瓜6457为单性花,花冠黄色,花瓣5 ～6 片,花冠裂片宽尖,雌花花萼萼片中等,具有单性结实特性(图5-A、B、C、J)。M2花器官变异性主要表现为雄花花瓣数增多,花冠裂片宽圆(图5-D)；雄花花柄较长(图5-E)；花冠表现为全裂(图5-F、G)；花萼萼片突变成绿色的细窄小叶(图5-H)；两性花突变体(图5-Ⅰ)；花瓣颜色变为浅黄色(图5-K)。

表2 M2 诱变群体中叶、花、果实、植株性状等的变异Table 2 Phenotypic variation of leaf, flower, fruit and plant in the M2mutagenesis population

图4 M2 真叶突变表型Fig.4 Mutant phenotypes of euphylla in M2 pla nt s

2.3.4 M2果实突变表型变异分析 野生型黄瓜6457 以主蔓结瓜为主,短棒状,瓜长约25 cm,瓜把钝圆,瓜色浅绿均匀,瓜面稍显光泽,不灰暗,微棱,有不太明显的小瘤(图6-A、B)。M2群体中变异性状,主要表现为果柄变短(图6-C、D)；果柄变长,约为野生型的2 倍(图6-E、F)；瓜面平滑,无刺瘤,无蜡粉,瓜形似欧洲温室型(图6-G、H)；植株长势弱,突变为毛密刺,刺毛细柔(图6-Ⅰ、J)；瓜把瓶颈形突变体(图6-K)；瓜把溜肩形突变体(图6-L)；有的植株果实变短(图6-M、N、O、P),果柄朝下,几乎无刺毛(图6-M)；瓜长变短约为18 cm,瓜型为短圆筒状(图6-N)；瓜长和瓜把都变短,小瘤刺瘤上移(图6-O)；果实两端宽圆,瓜把不明显,瓜型变为椭圆形,瓜面平滑无瘤(图6-P)；突变体瓜把变为细长型,约9 cm,瓜面有光泽且鲜亮(图6-Q、R)；瓜长变长,约38 cm(图6-S)；瓜面棱沟明显,较浅(图6-T)；瓜瘤较明显,瓜面略显不平状态(图6-U)；刺瘤上移(图6-Ⅴ)；刺瘤下移(图6-W)；超级子房突变体(图6-X)。

图5 M2 花突变表型Fig.5 Mutant phenotypes of flower in M2 plants

2.3.5 M2株型突变表型变异分析 野生型黄瓜6457 属无限生长型,主蔓棱柱形,分枝性弱(图7-A)。M2中株形变异性状变异的类型主要为植株无生长点,不能够正常生长(图7-B)；植株花打顶(图7-C)；节间变短,植株矮小(图7-D)；主蔓无刺毛(图7-E)；茎变成圆柱形(图7-F)；茎变为扁平状,且节间缩短(图7-G)。

3 讨论

目前EMS 已被广泛应用于作物诱变育种,且最佳诱变条件的确定对突变体库的成功构建至关重要[23-26]。本试验以5 个浓度梯度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)和5 个时间梯度(4、6、8、10、12 h)的组合,根据诱变后黄瓜6457 种子的发芽率、成苗率,综合分析得出EMS 浓度是处理黄瓜种子的关键因子[27],最终筛选出1.5%EMS 处理10 h 为诱变处理的最适条件。张兵[21]采用1.0%EMS 对山农5 号黄瓜种子进行不同时间诱变处理,综合考虑突变密度和可遗传后代,最终确定1.0%EMS 处理22 h 为最佳诱变条件。王晶等[19]利用6 个浓度梯度和5 个时间梯度组合的EMS溶液对长春密刺的黄瓜种子进行处理,综合分析认为致死率26%～28%为合适的诱变条件,最终确定了1.0%EMS 处理10 h 或1.5%EMS 处理8 h 为最佳诱变条件。薛存宝[20]设置5 个EMS 浓度梯度对黄瓜649 种子进行处理,分析出苗率,最终确定1.5%EMS和2.0%EMS 为最佳诱变条件。本研究筛选的最佳诱变条件与前人研究结果存有一定的差异,推测其可能与黄瓜的基因型有关。

图7 M2 株型突变表型Fig.7 Mutant phenotypes of plant in M2 plants

本试验利用1.5%EMS 溶液处理2 500 粒黄瓜6457 种子10 h,获得由1 204 个单株组成的黄瓜突变体库M1群体。对植株全生育期的表型进行田间调查,发现经EMS 处理的材料,表现为发芽慢、植株矮小、真叶褶皱,还发现一些叶片皱缩、叶色嵌合、植株多卷须、矮化、黄化、白化、畸形、果实嵌合体等变异性状,这与张兵[21]、朱娜娜[23]、陈宸[28]的研究结果相一致。对M1表型变异的植株进行自交留种,发现这些表型变化在M2中不能再观察到,进而推断M1植株所表现的变异多数是由化学要害造成的。但对M1群体进行全生育期的初步调查仍具有重要的意义,一方面可以更好地了解诱变效果,另一方面也为M2群体的调查提供一定的依据和方向。

M1共得到221 份种子,每一份种子作为一个家系,M2共得到含有221 个家系的1 506 个单株的突变体库,共筛选到176 个突变单株,38 个变异性状。这些变异性状主要包括子叶白化、子叶黄化、子叶畸形、三子叶、真叶心形、真叶近圆形、花冠全裂、花萼叶片化、瓜条圆筒状、瓜条纺锤形、长瓜把、主蔓扁平、矮化植株等。本试验筛选的长瓜把突变体,在王晶等[19]和张兵[21]所构建的突变体库均有呈现。本试验还发现了一株瓜均无毛、光滑、花冠变小的较特殊的变异植株。本试验所构建的黄瓜突变体库,包含多个重要表型变异材料,加快了黄瓜种质创新和新品种选育的进程。

4 结论

本研究利用不同EMS 浓度在不同处理时间诱变黄瓜自交系6457 种子,根据诱变后种子的发芽率和成苗率,筛选出1.5%EMS 诱导10 h 为最佳诱变条件,构建了含有221 个M2株系的黄瓜突变体库。诱变后M1出现皱缩叶、叶片黄化突变体、花打顶、果实嵌合体、矮化植株、畸形植株等变异类型,表型突变频率达到18.9%；M2植株筛选到176 个突变单株,38 种表型变异,性状变异集中在子叶、真叶、花器官、果实、植株上,总的表型突变率达11.7%。本研究结果为黄瓜育种和功能基因组学的研究提供了重要的基础材料。