改进的固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸残留量

(1.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310017；2.岛津技迩(上海)商贸有限公司，上海 200052)

草甘膦( Glyphosate，GLY)是一种高效、低毒、廉价的内吸传导型广谱灭生性除草剂，广泛运用于全球各个农业领域[1]。草甘膦在环境和生物体内不断富集, 通过食品和饮用水进入人体内, 对人体造成危害[2]。随着全球草甘膦使用量不断增大，其残留问题越来越受到关注，欧盟和日本作为我国茶叶出口的两大重要市场，均对茶叶制定了极为苛刻的农药残留限量标准[3，4]。我国食品安全国家标准GB2763—2014《食品中农药最大残留限量》规定，茶叶中草甘膦限量为1 mg /kg。研究表明，GLY 及其主要降解产物氨甲基膦酸( Aminomethyl phosphonic acid，AMPA) 具有与有机磷化合物类似的毒理，主要是与胆碱脂酶结合, 能引起神经过度兴奋、运动失调, 昏迷, 呼吸中枢麻痹, 瘫痪甚至死[5]。新西兰等国家对草甘膦的限量要求即包括GLY 和AMPA 的总和。

由于GLY 和AMPA均为强极性两性化合物，因其难挥发而在应用于气相色谱(GC)和气质联用(GC-MS)检测时，因气化需要引入许多物质，操作相对繁琐，而由于其紫外光区无吸收的特点，无法用带紫外检测器或者二极管阵列检测器的液相色谱进行检测[6-8]。而目前普遍采用的检测方法是GLY和AMPA经净化处理后，在硼酸盐缓冲溶液中经9-芴甲基氯甲酸酯( FMOC-Cl)衍生化，形成在液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)上响应较好的衍生产物GLY-FMOC和AMPA-FMOC[9，10]。

现有行标检测方法前处理，特别是净化过程繁琐复杂，耗费较多试剂，基质干扰大，耗时费力。目前常用的液-液分配萃取-离子交换柱净化技术试剂用量大、操作步骤多，尤其在洗脱过程中选择不合适的离子交换柱会造成回收率偏低，给样品准确定量造成很大的困难[11-13]。本文对GLY 和AMPA的色谱和质谱条件进行了优化，并对前处理提取净化方式进行了改进，过程简单，方法快速，回收率和重现性较好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津公司高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，配Shimadzu LC-30A高效液相色谱仪;Shimadzu LCMS-8050串联四级杆质谱仪;Mili-Q去离子水发生器(美国Millipore公司);MS3旋涡混合器。

草甘膦(GLY)、氨甲基膦酸(AMPA)(纯度≥99 %，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，纯度≥98%，百灵威公司)；乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；乙酸铵、硼酸钠、二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；WondaSep Glyphosate固相萃取柱(500 mg，6 mL，岛津技迩公司)。

1.2 色谱和质谱条件

色谱柱：InertSustainBio C18(3μm，2.1 mm×150 mm)；流动相：A相为5 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.1 %甲酸)，B相为乙腈；梯度洗脱程序：0～6 min，92%～65% A；6～7 min，65%～5% A；7～9 min，5% A；9～9.01 min，5%～92% A；9.01～14 min，92% A。柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min，进样量5 μL；运行时间：14 min。

离子源：电喷雾离子源(ESI)，负离子检测方式(ESI-)；多反应检测(MRM模式)；接口温度：300 ℃；离子源电压：3.5 kV；加热模块温度：400 ℃；DL温度：250 ℃；干燥气流速：10 L/min；加热器流速：10 L/min；校准方法：质量轴自动调谐校正；其他质谱分析参数详见表1。

表1 GLY和AMPA的质谱分析参数

注：*为定量离子对

1.3 标准溶液的制备

分别精密取GLY和AMPA标准品各约10 mg，分别用超纯水溶解转移至10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL，作为对照品储备溶液(浓度约为1000 mg/L)。分别精密吸取两种对照品储备溶液适当体积于10 mL容量瓶中，用水稀释定容，配置成1.0、5.0、10、20、50、100 、250 μg/L的标准品系列溶液。

1.4 供试品溶液的制备

提取：准确称取试样约1 g，于50 mL离心管中，加入10 mL去离子水，旋涡混匀1 min，静置浸泡1 h，加3 mL二氯甲烷，旋涡混匀1 min，以8000 rpm下离心2 min，取3 mL上清液于15 mL离心管中，加0.9 mL乙腈，混匀，待净化。

净化与衍生：将上述待净化的提取液上样于已活化好的WondaSep Glyphosate固相萃取柱(依次用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子)，取净化好的流出液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混匀，室温衍生过夜后，用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

精密取浓度为1.0 mg/L的GLY和AMPA标准溶液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混匀，室温衍生过夜，将衍生好的两种标准溶液分别注入进样器，随流动相直接进入质谱仪进行母离子和子离子扫描。实验发现，GLY-FMOC和AMPA-FMOC在负离子模式下的方法的稳定性和重复性较正离子模式好，故本方法采用负离子模式进行检测。

在负离子模式下对GLY-FMOC和AMPA-FMOC进行母离子扫描，扫描范围为m/z350～450，得到 [M-H]-峰，分别为m/z391.9和m/z333.9。确定GLY-FMOC和AMPA-FMOC母离子之后，调节离子源电压，最终当离子源电压为3.5 kV时一级扫描相应最高。确定母离子及其条件后，继续进行子离子扫描，以得到最佳的二级质谱条件，经仪器自带的二级质谱参数自动优化程序，得到GLY-FMOC和AMPA-FMOC的二级质谱优化参数(详见表1)。最终将优化后得到的定量定性离子对、碰撞能力以及Q1和Q3预四级偏置电压作为GLY-FMOC和AMPA-FMOC的MRM扫描参数。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本方法先后使用Themo Hypercarb(100*2.1 mm，3 μm)、InertSustain AQ-C18(100*2.1 mm，1.9 μm)、InertSustainBio C18(100*2.1 mm，3 μm)等3种色谱柱进行分离比较。采用Themo Hypercarb、InertSustain AQ-C18色谱柱，GLY峰型拖尾严重，而采用InertSustainBio C18色谱柱草甘膦峰型对称、尖锐。分析原因是：GLY含有磷酸基团，该基团会和色谱柱不锈钢柱管上残存的金属离子结合形成螯合物，导致峰型拖尾，而InertSustainBio C18色谱柱在技术上进行改进，在不锈管柱管和填料之间添加一层Peek内衬，隔绝了不锈钢柱管上残存金属离子与目标化合物的接触，从而峰型尖锐、对称，适合GLY及其代谢物的分析，具体MRM谱图见图1。

图1 草甘膦及代谢物MRM谱图

2.2.2 流动相的选择

实验考察了以下3组流动相在上述流动相梯度条件下的色谱行为：(1)A为乙腈，B为水溶液；(2)A为乙腈，B为5 mmol/L乙酸铵溶液；(3)A为乙腈，B为含0.1 %(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液。结果显示：流动相水中加入一定量的乙酸铵有助于离子化，流动相2下的目标化合物灵敏度明显比流动相1高，但流动相1和2的目标峰有明显的拖尾现象(详见图2)，所以本实验在流动相3的基础上加入0.1 %的甲酸，既提高了离子化程度，也改善了色谱峰拖尾现象。所以最终将流动相3作为检测GLY和AMPA的最佳选择。

图2 流动相1和2的草甘膦及其代谢产物的MRM结果

2.3 提取和净化方式的优化

由于GLY和AMPA有很强的极性，极易溶于水，一般采用纯水、硼酸盐缓冲液或者NaOH溶液等进行提取。本实验用上述3种提取剂进行回收率考察，结果发现纯水的提取效率最高，且样品经硼酸盐缓冲液和NaOH溶液提取后，提取液不容易过固相萃取柱，容易引起堵塞。由于GLY和AMPA不溶于有机溶剂，本实验在纯水的基础上加入二氯甲烷，可净化水取液中的脂溶性成分，所以本实验采用水-二氯甲烷体系来提取GLY和AMPA，结果表明两种目标物回收率较好，满足实验要求。

又由于GLY和AMPA含有磷酸基团(以及羧酸基团)和氨基碱性基团，且极性较大，因此本实验中采用阴离子交换小柱WondaSep MAX、阳离子交换小柱WondaSep MCX、反相模式固相萃取小柱InertSep HLB、对磷酸基团有特定吸附的MonoSpin PBA小柱以及草甘膦专用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate，并根据各小柱的特点及适用条件，对茶叶中草甘膦及其代谢物进行净化，采用WondaSep Glyphosate小柱净化，回收率最高，WondaSep MAX小柱次之，MonoSpin PBA小柱最低，具体见图3。最终选择草甘膦专用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate对茶叶进行净化。

图3 不同固相萃取柱净化的效果比较

2.4 线性关系、定量限以及重复性

取1.3中已配置的标准品系列溶液，分别进样5 μL，以定量监测离子对的离子流中谱峰峰面积(Y)为纵坐标，标准品浓度(X，μg/L)为横坐标进行线性关系考察，结果见表2。GLY和AMPA在各自线性范围内线性关系较好(r2均大于0.9992)。

取空白样品1 g，加入适当稀释的混合标准品溶液，按法制备供试品溶液，得信噪比为3和10时分别为GLY和AMPA的检测限(limits of detection，LOD)与定量限(limits of quantification，LOQ)，结果见表2。

取空白样品1 g，加入适当稀释的混合标准品溶液，使样品中GLY和AMPA最终浓度为50 mg/kg，按样品制备方法重复制备6份，测定GLY和AMPA的含量，重现性RSD在0.8 %～1.2 %，重现性较好，结果见表2。

表2 GLY和AMPA的的线性关系、检测限、定量限和重复性

2.5 方法回收率与精密度

取空白样品，每份称取样品1 g，分别加入适量的混合对照品溶液，使供试品溶液最终加样浓度分别为低、中、高3种(分别约为20、50、100 mg/kg)，平行3份，按样品制备方法制备供试品溶液，检测含量，计算回收率，结果见表3。GLY和AMPA的3个浓度水平的平均回收率为79.4 %～95.2 %，相对偏差为4.6 %～8.9 %。

以一定浓度的混合对照品溶液(约为50 μg/L)一日内5次重复进样峰面积的RSD作为日内精密度，以上述的混合对照品溶液3天重复进样(每天重复进样3次)峰面积的RSD作为日间精密度，考察方法的稳定性。结果见表3。GLY和AMPA的日内精密度为2.7 %～3.3 %，日间精密度为1.5 %～2.2 %。

表3 回收率与日内以及日间精密度

2.6 实际样品检测

利用本实验建立的优化后的前处理和色谱质谱条件完成了杭州市市场监管局2017年第二季度开展的茶叶监督检查计划，对杭州市市售的60批次茶叶中的GLY和AMAP进行检测。结果显示，GLY和AMAP均未检出。

3 结语

本研究建立了一种改进的测定茶叶中GLY和AMAP的固相萃取/HPLC-MS/MS法。样品经水-二氯甲烷体系提取后，经WondaSep Glyphosate固相萃取柱净化，用InertSustainBio C18色谱柱分析，以流动相为乙腈和5 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.1 %甲酸)梯度洗脱分离。本方法前处理简单，分离效果好，干扰少，回收率高，重现性好，可作为茶叶中草甘膦及代谢物的分析确证方法。