烟草类脂物提取及柱色层族组成分离方法研究

(1.陕西中烟工业有限责任公司，宝鸡 721013；2.中国农业大学，北京 100193；3.中国科学院地质与地球物理研究所兰州油气资源研究中心，兰州 730099)

烟草类脂物是烟叶表面物质的重要组成部分，化学成份复杂，其中的特征化学成份与烟草特有香气和吃味品质密切相关。因此，针对烟草类脂物中特征化学成分的有效分离并进行研究，对烟叶品质评价、配方研究、工艺生产都有十分重要的意义。

目前，烟草类脂物主要通过二氯甲烷或石油醚等溶剂直接萃取抽提[1]。这些方法普遍存在进样成份复杂、对设备污染较大、谱图解析干扰多等不足，不能全面系统地反映烟叶类脂物特征化学成分。

本实验首先通过对比不同方法及试剂的萃取效率，确定烟草类脂物最佳抽取方法，然后通过不同填柱比例确定了最佳填柱方法，实现了对烟草类植物族组成分离。最后用GC/MS进行定性分析，有效获取大量烟草化学成分信息[2-8]。此方法可以克服传统分析方法中的许多微量组分由于被主要组分掩盖而无法检测的不足，使烟草类脂物中特征化学成分的分析系统化和完整化。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

高中低档卷烟及烟叶样品均由陕西中烟工业有限责任公司提供，样品通过旋风磨粉碎后过筛，80目在30℃下干燥备用；二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇(Sigma公司)均为色谱纯；石油醚(国药)；硅胶(80～100目)、氧化铝(100～200目)。

电子天平(赛多利斯ME414S)；ASE快速抽提(DIONEX 200)；超临界萃取仪(美国Spe-ed)；超声萃取仪(德国Elma S300H)；旋转蒸发仪(步琪R-215)。

6890N-5973N气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；HP-5MS毛细管柱(50m×0.25mm×0.25μm，美国J&W公司)。

1.2 方法

1.2.1 烟草类脂物抽提方法(表1)

表1 不同抽提方法条件

准确称取3g烟草样品，通过表1方法抽提搜集到的抽提液放置在干燥皿中挥干后称重得到烟草类脂物的总重量。

1.2.2 柱色层族组成分离方法

本实验采用湿法填柱，先在柱底部放入高度为1cm脱脂棉(用二氯甲烷抽提过的)，用玻璃棒捣实，加正己烷润湿。硅胶和氧化铝用正己烷浸泡过夜，将硅胶和氧化铝按不同比例填柱，保持溶剂沒过硅胶表面。

(1) 洗脱非极性馏分。取一定体积的抽提物(含200 mg可溶物)上柱，用正己烷冲洗装上清液的容器3遍，一并倒入，待样品全部走完后，再用大量的正己烷冲洗，用量控制在300 mL，此时收集到的馏分为非极性馏分，收集完毕后上旋蒸，浓缩到5 mL，转移至称量瓶中，干燥称重，计算非极性馏分的重量。经正己烷定容后上GCMS检测。

(2) 洗脱弱极性馏分。在柱中继续加入100mL左右的二氯甲烷，此时收集到的馏分为弱极性馏分，收集完毕后上旋蒸，浓缩到5mL，转移至称量瓶中，干燥称重，计算弱极性馏分的重量。二氯甲烷定溶后上GCMS检测。

(3) 洗脱强极性馏分。在柱子中继续加入200mL左右的甲醇，此时收集到的馏分为强极性馏分，收集完毕后上旋蒸，浓缩到5mL，转移至称量瓶中，干燥称重，计算强极性馏分的重量。甲酯化处理样品后上GCMS检测。

色谱柱：J&W公司HP-5MS毛细管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)；分流比：10∶1；进样量：1μL；色谱柱程序升温：初始温度80℃，以4℃/min升至295℃，保持20min；

载气：高纯氦气；载气流速：1.0mL/min；进样口温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：3.5min；电离方式：EI；离子化能：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描方式：Scan模式；扫描范围：35～500amu。

采用NIST14标准谱库检索进行定性。

2 结果与讨论

2.1 烟草类脂物抽提方法对比

本实验着重考察了索式抽提法[9-11]、超声抽提法[12]、超临界二氧化碳萃取法[13]以及快速萃取仪ASE[14-16]方法的烟草类脂物抽提效率。选取3种规格成品样品及烟叶样品进行不同方法的类脂物抽提率对比实验，从表2及表3看出采用不同抽提方法所得抽提率差异较大；不同档次卷烟产品及烟叶的类脂物抽提率差异也较大，这可能和卷烟中添加的薄片及梗丝等有关。相比较而言，索氏抽提和ASE抽提法抽提率较高，但考虑到ASE快速抽提容易引起样品热降解及组分变化，而且ASE抽提法抽提所得到的沥青质比例较高，因此本实验排除了ASE抽提法，确定最佳抽提方法为索式抽提。

表2 烟草类脂物不同抽提方法抽提率对比

表3 不同抽提方法所得烟草类脂物族组成特征

注：①所有类脂物均采用硅胶∶氧化铝=3∶1的柱填料进行分离。②所用样品为烟叶。

2.2 不同有机溶剂抽提率对比

表4 不同溶剂对烟草类脂物抽提率对比

注：①均采用索式抽提方法，溶剂用量450mL。

对比了3种有机试剂的萃取效率。如表4所示，通过不同萃取溶剂的对比发现，3氯甲烷对样品的类脂物抽提效率更高，因此本实验确定抽提溶剂为三氯甲烷。

2.3 柱色层族组成分离方法

2.3.1 不同填料比例族组成比对

对比了不同填料比例的层析柱对烟草样品的分析效果，从类脂物不同比例柱层析分离的结果看(图1)，它们的族组成成分基本相似。但是通过对比各馏分的TIC图可知(图2～图4)，硅胶∶氧化铝为3∶2时，类脂物特征成分出峰更全，且通过表5～表7可以看出，各族组成化学成分能够实现很好的分离效果，且可以避免其他填料比例分离不充分引起的族组成混乱。

图1 类脂物不同填料比例柱层析分离效果

序号保留时间分子式分子量名称118.786C16H34226正十六烷221.516C17H36240正十七烷321.678C19H40268姥鲛烷424.143C18H38254正十八烷524.382C20H42282植烷625.32C20H38278新植二烯725.779C20H38278新植二烯异构825.883C20H38278新植二烯异构926.2C20H38278新植二烯异构1026.478C20H38278新植二烯异构1126.646C19H40268正十九烷1228.282C20H36292烷基呋喃1329.046C20H42282正二十烷1431.342C21H44296正二十一烷1533.548C22H46310正二十二烷1635.663C23H48324正二十三烷1737.701C24H50338正二十四烷1839.667C25H52352正二十五烷1941.55C26H54366正二十六烷2042.701C27H563802-甲基-二十六烷(异构二十七烷)2142.876C27H563803-甲基-二十六烷(反异构二十七烷)2243.458C27H56380正二十七烷2344.48C28H583942-甲基-二十七烷(异构二十八烷)2444.661C28H583943-甲基-二十七烷(反异构二十八烷)2545.133C28H58394正二十八烷2646.214C29H604082-甲基-二十八烷(异构二十九烷)2746.382C29H604083-甲基-二十八烷(反异构二十九烷)2846.899C29H60408正二十九烷2947.876C30H624222-甲基-二十九烷(异构三十烷)3048.109C30H624223-甲基-二十九烷(反异构三十烷)3148.497C30H62422正三十烷3249.564C31H644362-甲基-三十烷(异构三十一烷)3349.7C31H644363-甲基-三十烷(反异构三十一烷)3450.211C31H64436正三十一烷

续表5

图3 弱极性馏分色谱(TIC)图

序号保留时间分子式分子量化合物名称123.315C13H12O2200三甲基-苯蓖224.104C20H42O228直醇325.300C18H36O268植烯425.572C18H36O268降姥姣烷-2-酮527.299C20H32272植五烯627.396C20H32272植五烯异构

续表6

续表6

图4 强极性馏分色谱(TIC)图

续表7

续表7

烟草类植物的结构、细胞、纤维及超大分子有机质等组分在生产过程中并未遭到破坏，所以溶剂法抽提出的类脂物只是烟草中的游离有机质。极性馏分由图1、图3及表7可以看出是类脂物的主要馏分，其中又以脂肪酸为最高成分同时检测出甾醇(酮)；沥青质中主要有蛋白质、多糖聚糖、氨基酸等GC-MS无法分析的大分子化合物在类脂物中相对含量是仅次于极性化合物的馏分；非极性馏分(饱和烃)中主要成分是烷烃和新植二烯系列，烷烃系列主要存在于植物表层的植物蜡中。许多长链脂肪族有机物(脂肪酮、脂肪醇、脂肪酸及其酯等)的链断裂，成为这些烷烃的重要来源。但由于烟叶和卷烟丝还未经历较强烈的热作用或演化这样，所以链断裂过程较弱，因而本实验研究样品的类脂物中烷烃含量很低。新植二烯(含植物呋喃)系列是植物叶绿素α侧链-植烯醇的断裂衍生产物，在类脂物中含量也很低。弱极性馏分中主要有烟草中脂肪酸酯、含羰基和羟基化合物、甾类、维他命E、维他命K、细菌代谢物角鲨烯及胡萝卜素、番茄红素的衍生物等化合物，上述物质在烟草中均属于微量成分。通过索式抽提及族组成分离，本实验能够有效检测出174种烟草类脂物化学特征成分，其中非极性馏分46种，弱极性馏分57种，强极性馏分71种。

3 结论

本实验首先通过对比不同方法及溶剂的萃取效率，确定烟草类脂物最佳萃取方法及溶剂种类，然后通过不同填柱比例对比确定了最佳填柱方法，实现了对烟草类脂物的萃取及族组成分离，最后利用气相色谱-质谱(GC-MS)法进行分析。结果表明，烟草类脂物萃取最佳方法为索式抽提法，最佳萃取溶剂为三氯甲烷，柱色层填柱最佳比例为硅胶∶氧化铝=3∶2。通过本方法能够有效检测出174种烟草类脂物化学特征成分，其中非极性馏分46种，弱极性馏分57种，强极性馏分71种，使烟草中类脂化学特征成分的分析系统化和完整化可以更有效的检测类脂物中微量组分。