内向整流钾通道对少突胶质前体细胞发育的作用

海霞霞，朱娜，王俊燕，肖晶晶，毕逢辰，郑晓敏，李云鸿，王银

（宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004）

少突胶质细胞（oligodendrocyte，OL）是中枢神经系统中的髓鞘形成细胞，其发育异常与中枢神经系统多种疾病的形成有关[1]。研究[2，3]发现多种因子可以促进或抑制少突胶质细胞的分化，包括转录因子和神经元旁分泌因子等。内向整流钾离子通道Kir4.1在中枢神经系统中发挥着很多重要的作用，但是其在少突胶质前体细胞（OPC）的发育过程中是否发挥作用还是未知。有研究[4]表明，多发硬化症的病人在炎症状态下，Kir4.1通道的蛋白表达大量增加，产生Kir4.1通道的自身抗体。这提示在髓鞘相关疾病当中，Kir4.1通道可能参与其中并发挥某种作用。本文拟研究Kir4.1通道对OPC增殖和分化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠购自宁夏医科大学实验动物中心；DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibico公司；蛋白定量BCA试剂盒和Mouse抗HRP标记二抗购自Pierce公司；desipramine购自Tocris公司；MBP抗体购自Millipore公司；PCR引物由生工公司合成；GAPDH抗体购自Cell Signaling公司；Ki67抗体购自Abcam公司。

1.2 方法 （1）大鼠少突胶质前体细胞原代培养：剪下出生后3 d SD大鼠的头部，取出大脑，显微镜下去除其海马和血管膜留下大脑皮层；37oC胰酶消化20 min，打散细胞，培养在多聚赖氨酸铺的培养瓶；每3天换一次培养液；第7 d时，分别以200 r/min和1，100 r/min的转速37oC摇细胞1 h和16 h去除小胶质细胞和星形胶质细胞；将上清离心，沉淀便是少突胶质前体细胞，培养在多聚赖氨酸培养皿中。（2）利用Western blot检测Kir4.1和MBP表达：抑制剂Des处理前后，提取各组细胞的蛋白并收集上清液，BCA法进行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分离蛋白后转至PVDF膜，用脱脂牛奶在摇床上封闭膜2 h。加入一抗，4oC过夜。利用TBST充分洗涤膜后，用二抗室温孵育1 h，ECL试剂显色成像。（3）利用PCR检测Kir4.1和MBP mRNA水平：提取总RNA，反转录为cDNA，利用PCR试剂盒，依据操作步骤，进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶鉴定。

1.3 统计学分析 采用SPSS 11.9进行统计学分析。实验数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

2 结果

2.1 Kir4.1和MBP在OL细胞中表达升高 PCR和Western blot结果表明，OPC中和OL中都有Kir4.1基因和蛋白表达，但在OL中表达更高。MBP只在OL中表达，因为MBP是成熟的OL的标志。

2.2 阻断Kir4.1可以抑制OPC向OL细胞分化 Western blot结果显示，利用desipramine阻断Kir4.1后，MBP的表达显著减少，说明阻断Kir4.1抑制了OPC向OL细胞分化。

2.3 阻断Kir4.1可以促进OPC的增殖 抑制剂处理后，对细胞增殖因子ki67的检测结果显示，其表达增加，显示阻断Kir4.1促进了OPC的增殖。

3 讨论

少突胶质细胞发育异常会导致髓鞘形成障碍，形成多种中枢神经系统脱髓鞘相关疾病，比如多发硬化症、视神经炎等，给社会和患者家庭都带来了沉重的负担[5]。本课题的研究意义在于对中枢神经系统髓鞘相关疾病的机制进行探索，为治疗中枢神经系统髓鞘相关疾病提供一些理论基础。OPC向OL的正常分化是CNS髓鞘正常形成的必要条件。但是目前虽然对OPC分化机制的研究已经取得了一些进展，但其具体机制尚不十分清楚。

有研究[6]报道，在多发硬化症病人的OL上内向整流钾通道Kir4.1的免疫活性降低，但是Kir4.1对OPC发育的影响还不清楚。因此我们研究了Kir4.1对OPC发育的影响。

我们的实验结果显示Kir4.1在OPC和OPC中都有表达，但是OL中更高。阻断Kir4.1，促进了OPC的增殖，但是抑制了OPC的分化，其机制还有待于进一步研究。但是Kir4.1或许可作为髓鞘相关疾病的一个新靶点。