核移植介导的哺乳动物体细胞核重编程研究进展

吴霄 庄站伟 马晓莉 黄思秀 李紫聪 徐铮

（华南农业大学 国家生猪种业工程技术研究中心 动物科学学院 实验动物中心，广州 510642）

体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer，SCNT），也称克隆，是一种利用体细胞潜在的发育全能性去获得新的个体的技术。自1997年世界上第一例克隆羊“多利（Dolly）”出生至今，已有20多种哺乳动物被成功克隆出来，而2018年报道的世界首例克隆猴更是对灵长类动物研究的重大突破［1-2］。SCNT存在巨大的应用价值，如种质资源保护、良种扩繁、实验动物生产，以及以器官移植为目的的治疗性克隆。克隆猴的成功也使SCNT在研究人类阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症等疾病上的应用更近一步。

尽管SCNT在生命科学领域取得了一些成就，但该技术仍然存在巨大的应用缺陷。据统计，哺乳动物的SCNT胚胎的体内发育效率约1%-5%（出生数/卵裂期胚胎移植数），且克隆产生的后代往往出现死亡率极高和诸多发育缺陷的现象，如巨胎症、呼吸道疾病、免疫缺陷等［3-4］。在过去20年里，各国学者对SCNT的操作流程进行了各种优化，但这对提高克隆效率的作用甚微，阻碍SCNT胚胎正常发育的原因主要来自于胚胎自身发育过程中出现的供体细胞核重编程异常［5］。受精胚胎的重编程是指高度分化的精子和卵母细胞在形成受精卵后，胚胎的核发生一系列变化，恢复细胞发育的全能性，以指导胚胎的发育过程。但是SCNT胚胎的形成有别于受精胚胎，供体细胞核需要恢复其发育全能性以指导重构胚的正常发育，但这个过程存在着诸多障碍，尤其是表观遗传水平的重编程错误，最终只有极少数的胚胎能够正常发育、附植和出生。本文通过与受精胚胎的比较，重点介绍了哺乳动物SCNT胚胎中的供体细胞核重编程异常现象及其表观遗传修复机制的研究进展，并对一些与发育过程中的重编程相关的细胞和分子事件进行探讨。

1 早期SCNT胚胎的发育过程

供体细胞与去核卵母细胞形成重构胚的过程主要包括注射、融合和激活3个步骤。这期间，重构胚发生了一系列变化。供体细胞核进入卵母细胞质后，核膜迅速破裂（Nuclear envelope breakdown，NEBD），失去核膜的染色体由存在于卵母细胞质中的M期促进因子（M-phase-promoting factors，MPFs）促发染色体超前凝聚（Premature chromosome condensation，PCC）。在PCC期间，结合于染色体上的蛋白质会发生解离［6］。供体细胞和去核的卵母细胞融合后，通过电激活等物理方法和氯化锶、钙离子激活等化学方法激活卵母细胞，完成第二次减数分裂。重构胚激活后重新形成核膜，并开始进行DNA复制，在此期间由于重构胚的细胞核加入大量卵母细胞的蛋白质，染色质结构和蛋白质结合发生急剧变化［7］。随着合子基因组激活（Zygotic genome activation，ZGA）的启动，重构胚基因组逐渐恢复其转录，卵母细胞胞质中储存的RNA很快降解并由新合成的RNA取代，启动染色体重塑和其他表观遗传修饰的重编程。

2 核移植后的表观遗传修饰变化

SCNT后基因组发生的表观遗传修饰事件主要包括染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、印记基因的表达、X染色体失活等过程。

2.1 染色体重塑

染色体结构的改变与D NA复制、DNA重组、基因表达等生物学过程紧密相关。多能性细胞的特征在于比高度分化的体细胞具有更开放的染色质状态［8］。胚胎发育过程中，基因组形成大量的染色体开放区域促使位于该开放区域的关键调控元件介导胚胎基因组转录的启动。此过程中，一些转录因子会与封闭的染色质区域结合，打开染色质，如Oct4、Sox2、Kif4［9-10］。在 SCNT胚胎中，供体细胞染色体也需要通过重塑来启动胚胎的发育全能性［11］。Djekidel等对1细胞期的体外受精胚胎和SCNT胚胎以及作为供体的卵丘细胞进行基于微量样品的DNase I超敏感位点测序（low-input DNase I hypersensitive sites sequencing，liDNase-seq）， 发 现SCNT胚胎染色质重塑主要在激活后12 h内完成，但是，与受精胚胎相比，SCNT胚胎的大量DNaseI超敏感位点在供体细胞核重编程过程中丢失［12］。诱导多能性干细胞的实验中也发现，体细胞中的转录因子，如AP-1家族成员Jun，会通过阻止Oct4、Sox2、Kif4的作用来抑制供体细胞核的重编程［13］。另一项研究表明与受精胚胎相比，SCNT胚胎在染色质重塑的过程中部分区域未能成功进行重编程，而这些区域伴随着H3组蛋白第9位赖氨酸三甲基化（Histone3 lysine9 trimethylation，H3K9me3）和 DNA甲基化的富集，阻碍SCNT胚胎的重编程［12］。

2.2 DNA甲基化

DNA甲基化是生物体基因组中的一个重要表观遗传修饰，其中，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）是哺乳动物中的主要甲基化模式。5mC的建立与维持是通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）进行；而甲基化的擦除则是通过双加氧酶（Ten-eleven translocation，TET）介导将胞嘧啶上的甲基氧化为羟甲基、醛基和羧基，然后通过DNA糖基化酶进行碱基切除修复［14］。在胚胎发育早期，受精卵会发生广泛的去甲基化，其中父本基因组主动去甲基化，母本基因组被动去甲基化，基因组的低DNA甲基化状态为胚胎的全能性奠定了分子基础［15-16］。SCNT胚胎基因组的甲基化状态来源于其供体细胞，在重编程过程中去甲基化不完全，多数启动子仍然维持高甲基化。精子的染色质结构与供体成纤维细胞核之间的差异可能限制了SCNT中去甲基化机制的进行［17］。

通过小分子化合物DNA甲基化转移酶抑制剂，如 5-氮 杂 -2'-脱 氧 胞 苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dc）、zebularine、RG108等，降低供体细胞或胚胎基因组的甲基化水平是提高克隆效率的一个重要方法。通过5-aza-dc、zebularine处理供体细胞或SCNT胚胎的研究在小鼠、猪、牛等物种中都取得了一定的成果，成功降低了DNA甲基化的水平并在一定程度提高了SCNT胚胎的发育效率［18-21］。但是5-aza-dc 这类化合物对细胞具有毒性，对细胞生长存在危害。与之相比，RG108没有细胞毒性或遗传毒性作用，是一种较为理想的处理药物。Zhai等［22］利用RG108处理后的猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞，成功提高了SCNT胚胎的囊胚率（24.72% vs. 18.38%）。另一方面，TET介导的去甲基化作用也可以降低基因组中的DNA甲基化水平，TET3介导的DNA去甲基化涉及受精卵中父本DNA的表观遗传重编程，对于重构胚的发育非常重要。研究表明，卵母细胞中储存的TET3可以使小鼠SCNT胚胎的DNA甲基化得到擦除，而SCNT胚胎在重编程过程中的TET3不足似乎是无法支持完整去甲基化的一个重要原因［15，23-24］。Han 等［25］通过在供体细胞中过表达TET3成功提高了克隆山羊的出生率（3.6% vs. 1.5%）。高绍荣教授团队的最新研究发现，小鼠SCNT胚胎去甲基化过程中存在再次甲基化的现象，已经降低的基因组甲基化水平在二细胞期的SCNT胚胎中会再次提高，至四细胞期重新降低［26］。该研究在SCNT胚胎的2细胞阶段还检测到内源性逆转录病毒（Endogenous retroviruses，ERV）的长末端重复序列元件中存在异常DNA甲基化状态［26］。由于ZGA通常以ERV的激活为特征，上述发现正好验证了SCNT胚胎未能进行完整的ZGA的假设［27］。因此，Gao等［26］向去核卵母细胞注射了靶向DNA甲基化转移酶的小干扰RNA，阻碍DNA甲基化转移酶的表达，抑制了DNA重新甲基化，成功提高了小鼠SCNT胚胎的出生率（5.33% vs. 0.88%）。由于DNA去甲基化模式与发生阶段在各个物种中是不保守的，这种在小鼠SCNT胚胎中重新甲基化的现象在其他物种中是否保守还有待验证。

2.3 组蛋白修饰

组蛋白的氨基末端位于核小体的核心结构之外，作为一个信号位点与基因的转录调控密切相关。组蛋白修饰是指组蛋白的氨基末端与各种调节蛋白发生各种共价修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，不同的修饰模式对基因表达有不同的调控作用［28］。在正常受精胚胎发育早期，母本基因组组蛋白维持原有状态，而父本基因组组蛋白呈现高度乙酰化［29-30］。而在SCNT胚胎中，激活后的组蛋白修饰状态由供体细胞的状态向类似于受精胚胎的状态发育，但此前的研究发现，相比受精胚胎，SCNT胚胎始终保持着与供体细胞核相似的低水平的H4组蛋白第5位赖氨酸乙酰化（Histone4 lysine4 acetylation，H4K5Ac）和高水平的H3K9me3。因此，纠正异常的组蛋白修饰状态可能能够改善胚胎的发育状态。

通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）， 如 TSA、LAQ824 和 quisinostat等，调节组蛋白乙酰化水平可以有效改善SCNT 胚胎的发育效率［31-36］。Jin 等［36］利用 quisinostat处理SCNT胚胎，显著提高了SCNT胚胎的囊胚率（19.0% VS 10.2%）。另外，组蛋白乙酰化和DNA甲基化可能是作为相互独立的重编程障碍存在。一些研究利用TSA和5-aza-dc共同处理SCNT胚胎，在提高组蛋白乙酰化的同时降低DNA甲基化水平，在小鼠、牛等物种上都取得了一定的效果［37-39］。H3K9me3修饰作为转录抑制的标记，已被证实是表观遗传修饰重编程的主要障碍之一。Matoba等［40］首先通过过表达组蛋白去甲基化酶Kdm4d去除SCNT胚胎的H3K9me3，将克隆小鼠的出生率提高了7-8倍（1% vs. 8.7%）。类似的方法在人、猴、牛、猪身上都取得了一定的成果，但效果不如小鼠的显著［2，41-43］。Yang 等［44］发现一些关键的发育基因在胚胎内细胞团中受到H3K27me3的调节，而在外胚层细胞中被DNA甲基化沉默，这种修饰模式的组合有利于维持和调节胚胎发育的可塑性，同时也说明了H3K27me3和DNA甲基化是促进胚胎重编程的重要表观异常修饰。张毅团队最近的研究则表明，H3K27me3修饰也是一种供体细胞核重编程的主要障碍［7］。由于SCNT胚胎在重编程过程中未能建立完整的H3K27me3修饰，从而导致一系列印记基因的异常表达并使胚胎发育阻滞［45-46］。

2.4 印记基因

基因组印记是指通过表观遗传修饰控制某些特定的等位基因仅表达来自父本或母本一方的基因的现象，这类等位基因被称为印记基因。印记基因的表达具有时空特异性，即从原始生殖细胞发生到生物生长期间，基因组需要根据发育阶段和组织的不同建立、维持、擦除印记，控制印记基因的表达［47］。

研究发现，在SCNT胚胎中，存在印记基因异常表达的现象，如表达量异常、错误表达或不表达等。Wei等［48］在异常死亡的初生克隆猪胎盘中检测到IGF2，H19，PEG3和GRB1的表达量异常。Yang等［49］在死亡克隆犊牛的8个器官中发现了IGF2，IGF2R和H19的表达量异常。Hiroaki等［50］利用RNA测序鉴定出克隆小鼠的胎盘中Sfmbt2、Gab1、Slc38a4等印记基因出现双等位基因表达的状态。由于印记基因的功能往往与胎儿生长发育相关，因此印记基因的表达异常也是导致SCNT胚胎异常发育的主要原因之一。

了解基因组印记对印记基因表达模式的调控将有助于纠正SCNT胚胎中印记基因的异常表达。其中，DNA甲基化是哺乳动物中的主要基因组印记。印记基因中的部分CpG岛在父母本基因组中具有显著的DNA甲基化差异，称为差异甲基化区域（Differentially methylated region，DMR）。DMR 是印记基因的单等位基因表达的决定因素，能够维持印记基因在父母本中的差异表达。Hiroaki等［50］通过检测DMR的DNA甲基化水平验证了SCNT胚胎中Gab1等印记基因的异常表达。Yu等［51］发现父本印记基因RTL1是影响猪SCNT胚胎早期流产的关键基因，由于RTL1在SCNT胚胎中的DNA甲基化印记未能正常擦除，抑制了其正常表达，而通过对RTL1进行剂量补偿表达，可以显著地提高SCNT胚胎移植受体的怀孕率。与DNA甲基化相似的，组蛋白修饰也可以作为基因组印记控制印记基因的表达，Wee等［31］发现印迹基因NDN和XIST在克隆牛胚胎中的异常表达与H4K5Ac相关，这说明H4K5Ac可能是一种基因组印记。另外，H3K27me3修饰也被确认是一种位于母本基因组上的印记，Inoue等［52］认为H3K27me3修饰在卵子发生过程中逐渐建立并成为印记基因的印记，同时在植入前胚胎中母本H3K27me3的擦除会诱导X染色体失活。

2.5 X染色体失活

X染色体失活（X-chromosome inactivation，XCI）是指在哺乳动物中，雌性个体选择性失活一条X染色体来保证雌雄个体在X染色体连锁基因的基因表达量的一致性的过程［53］。在雌性的受精胚胎发育过程中，X染色体会始终保持一条染色体失活。早前的研究在SCNT胚胎中检测到X染色体存在异常表达，胚胎细胞中出现了一条、两条激活的X染色体或没有染色体激活的现象［54］。由于XCI主要通过印记基因Xist转录长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）并包裹X染色体形成，因此XCI的异常一般是Xist基因的异常表达引起的。研究表明通过敲除或干扰Xist基因可以有效的纠正异常XCI，并显著提高小鼠的克隆效率［55］。同时这种方法对大型哺乳动物克隆效率的提高也起到了一定的效果［43，56-57］。但是敲除Xist基因的方法对克隆动物的生长及繁育有巨大的弊端，纠正Xist异常激活的机制并维持单个X染色体激活才是更持续性的策略。研究发现，Xist在卵母细胞中一直保持沉默直到胚胎激活后才被激活，传统的观点认为这期间Xist的母本印记是DNA甲基化。但是近年的研究表明Xist的母本印记与另外两种印记有关，即H3K9me3 和 H3K27me3［52，58］。这两种印记都是通过在Xist上富集来抑制该基因的表达，但在SCNT胚胎中均检测到两种印记的丧失。这些研究暗示通过建立印记沉默Xist可能是维持单个X染色体正常激活的有效措施。

3 其他重编程事件

除了上述几种表观遗传修饰机制，还有许多其他的重编程事件被证明与胚胎发育相关，如端粒长度的维持、lncRNA的调控、ERV的转录激活，这些重编程活动可能也会影响SCNT胚胎的正常发育。端粒在细胞分裂过程中会逐渐缩短，当到达某个阈值时，细胞会停止分裂并进入死亡程序。研究发现，克隆羊Dolly的端粒长度仅为正常长度的80%，同时在猪、牛等其他物种中也发现克隆后代端粒缩短的现象［59-61］。端粒长度的维持和延长需要端粒酶同端粒结构的结合来进行，而端粒结构又受端粒表观遗传修饰的调节［62］。因此，SCNT胚胎的异常的表观遗传修饰和染色质开放性可能会改变端粒酶对端粒的调控而影响端粒长度［63］。lncRNA在细胞分化和生物体发育过程中发挥关键功能，已经证明卵母细胞的lncRNA在核重编程和早期胚胎发育中具有关键作用，尤其是染色体重塑的过程中。胚胎在不同的发育阶段也会受到不同lncRNA的调控，即lncRNA的调控具有阶段特异性［64-65］。而Wu等［66］研究则表明阶段特异性的lncRNA未在SCNT胚胎中正确表达，并且卵母细胞来源的lncRNA也未在ZGA后降解。lncRNA的正常降解和转录过程可能在SCNT胚胎中受到抑制，从而导致了胚胎的发育阻滞。上文提及的ERV是在表观遗传修饰重编程期间重新连接基因表达网络的多功能参与者，在ZGA时转录激活，然后通过DNA甲基化，组蛋白修饰，转录后沉默等机制抑制。因此，研究ERV活化可以为研究ZGA过程的分子机制和提高SCNT胚胎的发育潜力提供新的思路［67］。

4 展望

在SCNT中，供体细胞核的重编程存在诸多障碍，尤其是表观遗传修饰的重编程。如何研究并展现SCNT胚胎的重编程过程，了解其与受精胚胎发育的差异，并且纠正这种差异是今后SCNT研究亟需解决的问题。随着组学技术的广泛应用，胚胎发育过程中的转录组、表观遗传组的变化得以呈现。尤其是近十年来，基于微量样品的测序技术开始应用于发育生物学的研究，如单细胞转录组测序、单细胞甲基化测序。这些技术共同描绘出受精胚胎和SCNT胚胎发育重编程过程中的转录组及表观修饰组的动态图谱，对了解SCNT胚胎发育的屏障有着重要的意义。正常受精胚胎从原始生殖细胞的生成便已经开始为重编程做准备，而SCNT胚胎的正常发育只能依靠供体细胞核的重编程，最终只有少数胚胎能够正确完成重编程并顺利发育。近期的一项研究建立了一种称为“Waddington-OT”的方法，这种方法能够推断祖先后裔的命运，并对其可能的调控机制进行建模。同时该研究还预测并证实了能够提高细胞重编程效率的转录因子Obox6和细胞因子GDF9［68］。Waddington-OT方法及其他推演细胞发展轨迹的研究将使了解胚胎重编程中的细胞命运并加以调控成为可能，如何运用这类方法来提高SCNT的效率将会成为未来研究的一个重要方向。