调控植物种子发育的转录因子研究进展

吴玉 沈永宝，2 史锋厚，2

（1. 南京林业大学林学院，南京 210037；2.南方现代林业协同创新中心 国家林业局南方林木种子检验中心，南京 210037）

植物种子发育分为形态发育和种子成熟两个阶段［1］，每个阶段都由相应的转录因子调控和监管［2］。转录因子包含DNA结合区（DNA-binding domain，DBD）、寡聚化位点区（Oligomerization site，OS）、核定位信号区（Nuclear location signal，NLS）和转录调控区（Transcription regulation domain，TRD）4个功能结构域［3］，通过这些结构域与顺式元件相互作用调控基因的表达。已知参与调控种子发育第一阶段（形态发育）的转录因子有WOX（WUSCHEL-related homebox）、HAP3（Heme-activated protein3）等，参与调控种子发育第二阶段（种子成熟）的转录因子有 B3（B3 superfamily）、bZIP（Basic region/leucine zipper motif）等，参与调控植物种子大小的转录因子 有 AP2/EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins）、bHLH（basic helix-loophelix protein）等。有的转录因子如HAP3（Hemeactivated protein3），全程参与种子发育的每个阶段，而有的转录因子如MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog），则是种子发育过程中某个特定阶段所独有的。本文对植物种子发育过程中转录因子的种类、结构和功能进行概述，解析其作用顺序和分子调控机理，以期为植物种子品质改良研究提供相关理论支持和技术参考。

1 调控种子发育第一阶段（形态发育）过程中的转录因子家族及其功能

种子发育第一阶段主要是胚、胚乳和种皮的形态发育，胚的发育始于胚囊中的卵细胞和精细胞形成的受精卵（合子），经过一系列变化形成原胚，原胚经细胞分裂与分化后，发育成为具有子叶、胚芽、胚轴和胚根的完整胚。胚乳在细胞增殖、区域化和细胞分化后，发育成为胚胎提供营养的组织，胚乳的发育始终早于胚的发育。被子植物种子的胚乳由胚囊中的2个极核或次生核与1个精细胞受精发育而成，裸子植物种子的胚乳是由1个雌配子体细胞发育而成。种皮由胚珠的珠被发育而成，包围在胚和胚乳外面起保护作用。已知调控胚和胚乳发育的的转录因子有WOX家族、HAP3家族、MADS-box、NAC家族和bHLH家族；调控种皮形态发育的转录因子有bHLH家族和MYB家族。

1.1 WOX家族

WOX转录因子包含65个氨基酸残基组成的同源异型结构域，根据系统进化关系分为远古支、中间支和WUS支［4］。在双子叶植物拟南芥中，中间支WOX2、WOX8和WOX9基因共同监管早期胚的发育形成，第一次细胞分裂后，WOX2标记顶端细胞，WOX8和WOX9标记基底细胞。至典型八细胞期，WOX9和WOX2在形成下胚轴及部分根的中间区发挥作用，WOX8在胚柄细胞表达，WOX8和WOX9作用于产生根分生组织的胚根处。Zhu等［5］研究发现在裸子植物挪威云杉（Picea abies）中，WOX基因和生长素转运基因参与胚胎的形成，中间支WOX2、WOX8和WOX9的同源基因PaWOX2和PaWOX8/9在原胚形成阶段高度表达，并且在完整胚的形成中拥有相似表达模式。WUS支的WOX2、WOX3以及WOX4基因在胚体、边缘分生组织以及维管束系统中表达。Palovaara等［6］研究发现在拟南芥胚的发育过程中，WOX基因与激素互作，共同调控胚芽发育。此外，WOX转录因子还与其他转录因子相互作用，在胚的早期发育阶段，WOX8和WOX9在受精卵、基部子细胞和下胚轴细胞中被WRKY2转录因子激活。由此可见，WOX转录因子家族在植物种子胚形期发挥重要作用，促进细胞分裂和阻止未成熟细胞的提前分化。

1.2 HAP3家族

HAP3转录因子包含不保守的A区、C区和保守的B区3个结构域，根据B区氨基酸序列相似性将其分为LEC1（LEAFY COTYLEDON1）型和非LEC1型，Kwong等［7］研究发现拟南芥中LEC1是胚胎发生早期和晚期正常发育所需的关键调节因子，在营养细胞中诱导胚胎发育，编码CCAAT结合转录因子的HAP3亚基，是调控胚形成的必要因子。Jo等［8］研究表明LEC1在拟南芥种子发育中的胚细胞和胚乳组织中表达，是控制胚和胚乳发育的中心调节因子，可激活胚形态发生和细胞分化所需的基因转录。Pelletier等［9］研究发现LEC1在拟南芥和大豆种子不同的发育阶段控制着不同的基因组，包括在种子发育早期和种子成熟过程中介导光合作用和叶绿体之间的基因组。Hu等［10］研究发现 LEC1调节拟南芥和大豆胚形态发生基因的表达，以及胚发育早期生长素的合成。Boularda等［11］研究发现LEC1全程参与植物胚胎染色质状态的长期重编程。Orlowska等［12］研究发现LEC1在胚胎形态发生中诱导体细胞胚发育。Huang 等［13］通过比较拟南芥野生型和lec1突变体之间毛状体发育相关的基因表达发现，LEC1在胚细胞发育后期起着决定性作用。由此可见，HAP3转录因子家族是植物种子胚发生发育过程中的关键调控因子，控制着胚胎发育过程中的多个方面。

1.3 MADS-box家族

MADS-box的名称来自NCM1（酿酒酵母转录因子）、AGAMOUS（拟南芥花同源异型基因）、DEFICIENS（金鱼草花同源异型基因）和SRF（人血清应答因子）这4类蛋白的首字母，均包含高度保守的由56-58个氨基酸组成的MADS-box结构域［14］。A、B、C、D、E类MADS-box基因是经典植物花器官发育模型的主要基因，D类基因主要负责调控胚珠的发育。Angenent等［15］研究发现矮牵牛的D类基因FBP7和FBP11对胚座以及胚珠的发育进行调控。Chen 等［16］研究发现兰花中的D类MADS-box基因调控了胚珠发育的分子机制。Suárez Baron 等［17］研究发现马兜铃花中的D类同源基因AfimSTK是花药和胚珠中孢子组织特性的关键因子。Ehlers 等［18］研究发现拟南芥的D型同源基因SHP1、SHP2调控胚珠发育。由此可见，MADS-box家族的D类基因在调控胚珠发育中至关重要。

1.4 NAC家族

NAC的名称来自矮牵牛NAM（NO APICAL MERISTEM）基因和拟南芥ATAF1/2和CUC（CUPSHAPED COTYLEDON）基因的首字母，各成员的N 端均含有高度保守的 NAC 结构域［19-21］。Tadashi等［22］研究发现拟南芥中的NARSl和NARS2基因负责调控胚珠珠被的生长和退化，敲除掉突变体nars1和nars2后，出现珠被退化推迟和种子外形异常。野生型植株由双突变体nars1和nars2授粉可生成具备正常外形的种子，反之种子外形出现异常。Christianson 等［23］从拟南芥中筛选出 NAC 转录因子ANAC102，qRT-PCR 试验结果显示ANAC102受低氧胁迫的诱导而表达，是水胁迫下参与种子萌发的重要调控因子。黄娟等［24］研究发现NAC转录因子负责调控水稻和小麦种子的发育、籽粒灌浆。朱娉等［25］研究发现小麦中的NAM基因能增加籽粒蛋白质积累，并促进锌、铁等微量元素吸收。Waters 等［26］研究发现NAC转录因子NAM-B1基因影响小麦中营养物浓度的分配。Uauy等［27］研究发现NAC转录因子TtNAM-B1、TtNAM-A1和TtNAM-B2能不同程度地促进籽粒中蛋白和锌、铁等微量元素的积累。吴丹等［28］研究发现中国春小麦中的NAM转录因子Gpc-1及Gpc-2参与调控籽粒中矿物元素的转运。胡喜贵等［29］研究发现野生二粒小麦中的NAM-B1基因可提高籽粒中蛋白质、铁、锌等物质的含量。由此可见，NAC转录因子家族调控珠被生长、蛋白质和铁、锌等微量元素的积累。

1.5 bHLH家族

bHLH（basic helix loop helix）转录因子的名称源于其含有保守的bHLH 结构域，通常以二聚体形式发挥作用，bHLH结构域含有碱性区域和HLH区域［30-31］。Kondou等［32］研究发现在拟南芥的胚胎心形发育时期，胚乳中的bHLH转录因子RGE1基因在控制胚胎生长中起重要作用。Feng等［33］研究发现bHLH转录因子ZmbHLH44（OPAQUE11）控制玉米胚乳中的贮藏营养代谢。Tanabe等［34］研究发现玉米种子发育中ZmbHLH在胚乳和胚胎发育过程中高度表达，参与了它们的发育。此外，还发现ZmbHLH87和ZmbHLH185在转移细胞中特异性表达，调节籽粒灌浆过程。Li等［35］研究发现芸苔中的bHLH转录因子BrTT8主要负责调节种皮中原花色素（PA）的积累。Gonzalez等［36］研究发现拟南芥种子的棕色由原花色素（PA或缩合单宁）在其内部种皮层中的沉积引起，TT2、TT8和TTG1组成的转录因子复合物控制PA生物合成基因的表达，一起调控芽表皮中的毛状体发育和外种皮层粘液产生细胞的分化。Padmaja等［37］研究发现TT8基因的突变是抑制芥菜黄种子突变体LBG转录所必需的，负责调控种皮颜色。由此可见，bHLH转录因子家族在调控胚胎、胚乳及种皮的发育过程中不可或缺。

1.6 MYB家族

MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子因含有Myb结构域而得名，其N端由 1-3 个串联 R 结构（R1、R2 和 R3）组成［38］。Matsui等［39］在拟南芥中通过嵌合AtMYB23阻遏物的表达发现MYB蛋白AtMYB23参与调控种皮发育。Luo等［40］研究发现将苦荞中分离出的FtMYB15基因在拟南芥中异位过量表达后，种皮中色素沉着增加，且花青素积累水平提高。Herniter等［41］通过PCR标记豇豆中的MYB113基因Vigun05g039500，发现其是豇豆黑色种皮颜色的候选基因。由此可见，MYB转录因子家族主要调控种皮发育和种皮中色素的积累。

2 调控种子发育第二阶段（种子成熟）过程中的转录因子家族及其功能

种子发育的第二阶段包括器官增大和种子成熟［2］，种子的大小由胚、胚乳和种皮三者的协调生长决定，种子的成熟以淀粉、脂类和蛋白质等贮藏物合成积累的完成为标志［42-43］。参与调控种子成熟和种子大小的转录因子有HAP家族、B3家族、Zinc finger家族、bZIP家族、AP2/EREBP家族、WRKY家族、IKU、MINI3、SHB1基因和KLU基因。

2.1 HAP家族

HAP3家族的LEC1转录因子参与调控种子成熟，Kagaya等［44］研究发现拟南芥中LEC1通过调 节FUS3（FUSCA3） 和ABI3（ABSCISIC ACID INSENSITIVE3）来控制种子成熟过程中贮藏蛋白基因（SSP）的积累，LEC1异位表达能够激活SSP基因表达和诱导FUS3、ABI3和LEC2的表达。Mu等［45］研究发现LEC1在脂肪酸合成环节发挥着重要的调控作用，在拟南芥中过表达LEC1会导致脂肪酸生物合成基因的全面增加的表达。Junker等［46］研究发现LEC1部分与脱落酸结合，影响生长素合成，参与调节胚胎和胚胎外细胞的伸长。Tan等［47］研究发现在甘蓝型油菜中条件性表达LEC1同源基因BnLEC1和BnL1L导致脂肪酸水平增加。由此可见，HAP3家族主要负责调节胚胎伸长、贮藏蛋白积累和脂肪酸合成。

2.2 B3家族

B3超家族分为LAV家族、ARF家族、RAV家族和REM家族，LAV家族又分为AFL（LEC2/FUS3/ ABI3）亚家族和HSI亚家族，两个亚家族成员均参与种子成熟的调控。Baud等［48］研究发现拟南芥中种子成熟转录由LEC2、FUS3和ABI3调控，LEC1在LEC2和ABI3作用下增强了OLE1启动子的活化，拟南芥原生质体中产生的重组LEC1和LEC2蛋白可在体外与NF-YC2形成调节性多蛋白复合物。Grimault等［49］研究发现AFL亚家族转录因子在玉米籽粒灌浆中发挥重要作用，鉴定出的LEC2、FUS3、ABI3的同源基因ZmAFL4、ZmAFL2和ZmAFL3 / ZmVp1可反式激活玉米油质蛋白启动子，调控胚乳储备物质积累。Roscoe等［50］研究发现拟南芥种子储备定量由AFL调控，ABI3、FUS3和LEC2共同调节种子成熟的储备，其中ABI3更大程度控制了储存蛋白质含量，FUS3则更大程度地控制了脂质含量。虽然ABI3控制整个胚胎的储备含量，但LEC2和FUS3也参与调节不同胚胎区域的储备。Fatihi 等［51］研究发现，拟南芥中AFL对于实现种子成熟的储存积累至关重要，LEC1是ABI3、FUS3 在上游发挥正调控作用的因子，对种子成熟行为进行控制，诸如12S 贮藏蛋白基因的表达、叶绿素与花青素的积累等。此外，FUS3和LEC1还负责调控种子内ABI3蛋白的丰度。Kagaya等［52］研究发现LEC1通过调节FUS3和 ABI3来控制种子贮藏蛋白基因，LEC1的异位表达对FUS3和ABI3的表达具备诱导作用，基于LEC1、FUS3与ABI3 的多突变体状况下，SSP这一种子贮藏蛋白的表达强度增强。可见LEC1对SSP基因表达的调控作用在一定程度上依赖于FUS3与ABI3。Boulard等［53］研究发现LAFL基因（LEC2、ABI3、FUS3、LEC1）编码调节种子发育不同方面的转录因子，调控胚胎从早期到晚期储存化合物的积累。这些转录因子调控胚胎发育和种子成熟之间的转换、成熟种子和发芽之间的转换。Boulard等［11］研究发现LEC1（NF-YB9）直接与LEC2相互作用以控制种子中的基因表达，LEC1与LEC2两者的互作并非表现为直接线性相关，LEC1、ABI3和FUS3 在LEC2异位表达诱导后积累，此积累仅在激活种子特异蛋白后发生。由此可见，LEC2可能联合LEC1、ABI3 与FUS3一起对种子成熟期进行调控，通过有序的互作行营造满足胚发育所需的细胞环境，对胚发育进行调控。

2.3 Zinc finger家族

Dof家族属于Zinc finger超家族，包含DNA结合域与特异转录调控域，主要调控种子的胚乳发育、贮藏蛋白的合成及脂肪含量的变化［54］。Kushwaha等［55］研究发现Dof转录因子PBFs在种子的发育阶段激活醇溶蛋白启动子转录，玉米ZmPBF、水稻PBF和小麦WPBF通过识别胚乳表达基因醇溶蛋白对应启动子中的 TGTAAAG 序列来激活其表达。除了醇溶蛋白基因以外，其他的胚乳表达基因如LKR基因，也被PBFs和Opaque-2共同调节。Gupta等［56］研究发现EcDof基因参与小米谷粒灌浆期间蛋白质的积累。王志坤等［57］研究发现在大豆中过量表达GmDof11，可观察到种子含油量升高，而蛋白质含量降低。Zhang等［58］最新研究表明，水稻中OsDof24和OsDof25能够调节种子贮藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表达。由此可见，Dof 转录因子家族在种子发育成熟过程中发挥着非常重要的作用。

2.4 bZIP家族

bZIP（Basic leucine zipper）转录因子是真核生物转录因子中最具保守性且分布最广泛的一类蛋白，由亮氨酸拉链区域和DNA结合碱性结构域组成［59］。Jakoby等［60］将拟南芥的bZIP转录因子分为了A、B、C、D、E、F、G、H、I和S10个亚族，不同亚家族发挥不同作用。Finkelstein等［61］研究发现C亚族bZIP 蛋白参与油菜中种子贮藏基因表达，Lara等［62］在拟南芥中通过原位杂交分析表明bZIP 转录因子AtbZIP10和AtbZIP25的表达从种子中的mRNA发育的早期阶段开始，在成熟时达到峰值，在种子发育后期开始下降，在时间和空间上匹配编码2S白蛋白和十字花科蛋白的种子贮藏蛋白基因。此外，通过酵母双杂交系统分析发现AtbZIP10/25与ABI3的共表达导致At2S1启动子的活化能力显着增加，表明它们是参与种子特异性表达的调节复合物的一部分。Gacek等［63］研究发现发现菜豆内G亚族bZIP蛋白ROM1和ROM2通过调节储存蛋白质基因的表达来调控种子成熟。由此可见，bZIP转录因子家族调控种子发育成熟过程中贮藏蛋白的积累。

2.5 AP2/EREBP家族

AP2/EREBP超家族包含60-70个氨基酸残基的AP2/ERF结构域，分成EREBP亚族和AP2亚族，EREBP亚族分为ERF、DREB和Soloist，AP2亚族分为 AP2、RAV［64-65］。Irish 等［66］研究发现 AP2 在控制拟南芥种子大小方面发挥重要作用。Wang等［67］研究证实AP2亚族参与调控种子的体积、重量、蛋白和油类的积累。Jiang等［68］研究发现APETALA2转录因子SNB（SUPERNUMERARY BRACT）调控水稻种子大小，其增加的颖片纵向细胞伸长导致ssh1突变体产生比野生型体积更大、粒重更高的种子。Ohto 等［69］研究发现拟南芥中AP2调控胚珠和种皮的发育，对等位基因ap2突变的分析表明 AP2活性直接影响种子质量，导致种子发育过程中己糖与蔗糖的比例发生变化；相互交叉实验表明AP2对种子质量的母体效应涉及胚细胞数和细胞大小的调节。Zhao等［70］研究发现AP2转录因子AtAP2同源基因OsAP2-1在水稻花与种子的发育中至关重要。Ohto等［71］研究发现AP2对胚胎、胚乳和种皮发育的影响决定了拟南芥的种子大小，AP2控制母系的种子质量，ap2突变体产生比野生型更大的种子。Cernac等［72］研究证实拟南芥内AP2/ EREBP 转录因子WRI（WRINKLED）与种子贮藏物新陈代谢行为相关，WRI表达水平减弱后种子无法有效完成蔗糖向三酯酰甘油的转化，导致油类物质在种子内积累量减少，WRI过度表达则可导致种子与幼苗所含三酯酰甘油量升高。Penfield等［73］研究发现拟南芥中DREB类转录因子ABI4是胚内ABA（脱落酸）作用的关键接受因子，具备抑制胚中脂质降解的功能，经由与ABI3、ABI5互作，对ABA的信号转导施加影响。Lasserre等［74］研究发现AP2/ERF转录因子AtERF38（At2g35700）基因对拟南芥种子次生壁产生具备正向调节作用，对拟南芥成熟种子实施GUS染色，借助RT-PCR法发现，AtERF38基因的表达量和次生壁增厚正向相关。由此可见，AP2/EREBP超家族在调控种子大小、种子贮藏物质积累和种子质量方面至关重要。

2.6 WRKY家族

WRKY家族各基因的N末端均包含“WRKYGQK”七肽序列的保守结构域，其名称来自缩写“WRKY”［75］。Garcia等［76］研究发现 WRKY 转录因子TTG2（TRANSPARENT TESTA GLABRA2）负责调控种子体积，对于胚乳生长发育进行空间层面的直接限制，主要在胚乳和珠被中表达，TTG2在调控种子体积上高度遵循孢子体母本效应，ttg2突变体受到胚乳细胞化提前的影响后种子胚乳变小，珠被细胞变短，种子由此变得圆且小。Gonzalez等［36］研究发现TTG2通过调节原花青素途径中的液泡转运步骤来控制拟南芥中种皮单宁的发育调控。Johnson等［77］研究拟南芥ttg2突变体发现，其种皮内缩合单宁的合成以及黏液质的累积受到抑制后种皮表现为浅黄色，大量缩合单宁合成渠道的中间产物集中于ttg2突变体的种子内，导致其细胞伸长的反应能力异常。Amato等［78］研究发现葡萄树WRKY转录因子TTG2同源基因VvWRKY26参与调节液泡运输和类黄酮生物合成，在空泡pH调节中实现PH3功能并恢复野生型色素沉着表型。然而此家族内MINI3则经由IKU-MINI3-SHB1途径对种子大小进行控制，在作用机制上完全不同于TTG2。由此可见，WRKY家族主要调控种子体积、胚乳的生长发育和种皮颜色。

2.7 IKU、MINI3和SHB1 基因

IKU-MINI3-SHB1调控途径涉及HAIKU1（IKU1）、富含亮氨酸的重复激酶HAIKU2（IKU2）、WRKY转 录 因 子MINISEED3（MINI3） 和 上 游的调节因子SHORT HYPOCOTYL UNDER BIUE1（SHB1）［79］。Wang 等［80］研究发现拟南芥胚乳和种子大小的发育受IKU途径调节，包括IKU1、IKU2和MINI3。Zhou等［81］确定SHB1基因是拟南芥种子发育的正调节因子，shb1-D突变体种子大小的增加与胚乳细胞化、合点胚乳增大和胚胎发育有关。SHB1在拟南芥体内与MINI3和IKU2的启动子结合，在种子发育的早期阶段促进种腔和胚乳生长。Xiao等［82］研究SHB1是种子发育的关键调节基因，在油菜中过量表达SHB1，较强的MINI3启动子调控SHB1、MINI3和IKU2的直系同源物，最终导致种子质量显著增加。Meng等［83］研究发现拟南芥中通过AN3-MINI3基因级联调节种子胚胎发育，SHB1与MINI3的启动子结合调节胚胎细胞增殖（细胞分裂和伸长）。由此可见，IKU途径是植物种子胚乳早期生长阶段的重要调控机制，主要调控种子大小、种子质量、胚乳生长和胚胎发育。

2.8 KLU基因

Anastasiou等［84］研究发现拟南芥中细胞色素基因KLU（P450 KLUH/CYP78A5）负责对种子大小进行调控，Zhang等［85］研究发现转录因子SOD7通过直接抑制拟南芥中的KLU表达来调节种子大小，SOD7通过限制胚珠和发育种子的分布中的细胞增殖来调节种子大小。Zhao等［86］研究发现拟南芥KLU同源基因GmCYP78A72调控大豆种子大小，在拟南芥中和大豆中的过量表达GmCYP78A72均导致种子增大。Adamski等［87］研究发现KLU调控胚珠和种子大小，KLU在内珠被中过表达促进细胞增殖和种皮生长，此外，KLU诱导种子体积增加提升了种子中的相对含油量。由此可见，KLU基因主要在调控种子大小和种子相对含油量。

3 展望

近年来，随着越来越多植物基因组测序的完成和植物转录因子数据库的构建，以及各类转录因子基因分离与功能鉴定新方法的开发极大推进了种子发育转录因子及其分子调控机理等方面的研究进展［88］。目前，已开发的各类转录因子基因分离与功能鉴定方法有：利用生物信息学已建立的数据库进行转录因子保守结构域分析、转录因子亚细胞定位分析等；通过瞬间转化法（基因枪法、电转化法、PGE处理法及农杆菌介导法等）和突变体表型法（基因过量表达法和基因功能缺失突变体法）进行转录因子基因功能鉴定；通过转座子标记、同源序列法、T-DNA 激活标签法、图位克隆法、酵母单杂交法实现转录因子基因分离。此外，还有酵母杂交法、染色体免疫共沉淀法（ChIP）、嵌合转录因子法等［89］。这些不断进步的技术和方法被运用到了种子发育转录因子的研究中，如通过瞬间表达法可以有效地鉴定出参与种子发育的目标基因［90］；借助突变体研究与分子遗传学技术已成功鉴定了部分影响胚乳发育的基因［54］；借助ChIP 技术测定了种子发育中成熟基因的表达［91］。由此可以预测，技术的进步将促使人类从新的角度更全面地探索控制种子发育的遗传机制，从而更加有效地进行作物种质资源的遗传改良。