内生真菌提高植物抵御盐胁迫的研究进展

李娥 胡华冉 李蛟男 杜光辉 刘飞虎，

（1. 云南大学生命科学学院，昆明 650091；2. 云南大学农学院，昆明 650091）

盐渍化（Salinization）是自然界中广泛存在的一种非生物胁迫［1］。目前，全球有8.31×108hm2土地受到盐渍化威胁，占全球耕地面积10%［2］，中国则有约1×108hm2盐渍土［3］，约1/5的耕地发生盐碱化［4］。盐渍化严重程度已经影响到农业和经济发展及环境的状况。目前，改善土壤盐渍化主要通过调整水利、平整土地、施用大量化肥、种稻洗田、种植盐生植物等措施进行［5］，但这些方法都有一定局限性，不能从根本上改善土壤质量状况及提高植物生物量。

近年来，研究发现某些植物内生真菌与植物共生，为植物直接提供营养或帮助植物获得营养，通过产生活性物质或信号转导增强宿主抗虫、抗病、抗胁迫（包括盐、旱、低温）能力［6-7］，还可以显著改变土壤微生物群落，改善土壤质量［8］。本研究从提高植物耐盐性内生真菌的发掘、内生真菌增强植物耐盐性机制等方面的研究进展、发展前景和存在问题进行综述与讨论，期望为发掘和利用内生真菌增强植物耐盐性的相关研究提供参考和启示。

1 植物内生真菌

1988年，Carroll［9］把植物内生真菌定义为生活在植物组织内生活史中的某一时期，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。根据系统发育和生活史特征，将植物内生真菌分为clavicpitagen（C）和nonclavicpitagen（NC）2个内生类群［10］。同时，植物内生真菌多属于双核菌门、子囊亚门的有核菌纲（Pyrenomyetes）、盘菌纲（Discomycetes）和腔菌纲（Loculoascomyetes）以及无形态的多种真菌，主要分布于植物各组织的细胞间，一般在叶鞘和种子中分布最多，而在叶片和根中含量极微［9］。1993年，美国科学家Stierle等［11］在短叶红豆杉的树皮上获得能合成抗癌活性紫杉醇的一种内生真菌，掀起植物内生真菌研究的热潮。目前，在地球上已知的25万种植物中，内生真菌数量在100万种以上［12］。

植物内生真菌与植物的抗旱、抗盐、抗虫、抗重金属等方面有关，其次生代谢产物（生物碱等）具有抗菌、杀虫、抗细胞毒性和抗癌等作用。植物内生真菌作为新型资源，在农业、医药和食品工业中有广泛应用前景［13］。Maciá-Vicente 等［14］认为环境胁迫使植物与内生真菌的关系更加紧密，以适应不利条件。所以，随着土壤盐渍化问题的日益突出，越来越多的学者关注与植物互作提高其耐盐性的内生真菌的研究。

2 与植物互作抵御盐胁迫内生真菌的发现

目前，报道最多的与植物互作抵御盐胁迫的内生真菌有丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）、印度梨形孢（Piriformospora indica）、有隔内生真菌（Dark septate endophytes，DSE）和木霉菌（Trichodermaspp.）等。研究发现，植物根系和叶片的内生真菌对抵御盐胁迫起的作用较大。其中，叶片内生真菌以局部侵染（Locally limited colonization）方式侵染植物，根系内生真菌以系统浸染（Extensive or systemic colonization）方式侵染植物，且侵染程度更强。根系内生真菌又有菌根真菌和非菌根真菌之分，而菌根真菌尤以印度梨形孢和丛枝菌为代表，而非菌根真菌则以暗色有隔内生真菌和红色不育真菌（Sterile red fungus，SRP）为典型代表［15］。

2.1 丛枝菌根真菌

德国植物生理学家Frank［16］于1885年发现某些真菌能与植物根系共生，首次提出了“菌根”（Mycorrhiza）这个术语。Bach［17］早在1983年就发现丛枝菌根真菌能在盐胁迫下侵染植物。目前，关于丛枝菌根真菌的分类有4个目，13个科，19个属，共 214 种［18］。

丛枝菌根真菌能与自然界90%的植物形成共生关系，提高其抗盐能力，并且通过不同方式和途径影响植物的生长［19-21］。在NaCl胁迫下，丛枝菌根真菌能促进盐生植物盐草［22］、银胶菊［23］等的生长，也能促进非盐生植物洋葱［24-25］、柑桔［26-28］、番茄［25，27］、黄瓜［29］等的生长。但丛枝菌根真菌对菌根植物的促进作用和侵染强度明显比非菌根植物（如苋科、藜科、肉桂科和十字花科）强［30］。

2.2 印度梨形孢

1998年，Verma等［31］在印度塔尔沙漠中发现了一种植物根定殖担子菌——印度梨形孢（Piriformosporaindica）， 隶属于担子菌门（Basidiomycota）、层菌纲（Hymenomycetes）、蜡壳耳科（Sebacinaceae）、梨形孢属（Piriformospora）。印度梨形孢能与多种植物共生，表现出较强的促生长能力。Waller等［32］于2005年发现梨形孢具有诱导大麦抗盐胁迫的潜力。迄今为止，研究发现接种印度梨形孢能提高烟草［33］、苜蓿［34］、墨西哥虎尾草［35］等多种植物的耐盐性。

2.3 有隔内生真菌

1905年，Gallaud［36］首先在2种植物（Allium sphaerocephalumL.和Ruscus aculeatusL.）根部发现有褐色或黑色的外生菌根。1922年，Melin［37］在松树根部也发现该真菌，并将其命名为Mycelium radices atrovirens（MRA）。直到1998年，Jumpponen和 Trappe［38］才提出有隔内生真菌（Dark septate endophytes，DSE）这一定义。目前，已在100科、320属、近600种植物中发现有隔内生真菌，但是关于有隔内生真菌的分类地位问题还很模糊［39-41］。

有隔内生真菌一直都被用来修复有害金属污染的环境［42］。但近年来的研究发现有隔内生真菌能与植物互作提高植物耐盐性［14］。而且在有隔内生真菌与宿主植物形成共生关系过程中，能促进植物生长、改善矿物质吸收、提高植物抗逆性［43］。Pan等［44］研究发现，盐胁迫下深色有隔内生真菌可侵染白杨，提高白杨苗木耐盐性。

2.4 其他与植物互作提高宿主耐盐性的内生真菌的发现

除上面3大类与植物耐盐性相关的内生真菌之外，人们陆续从各种植物中发现与植物互作提高宿主耐盐性的其他内生真菌。

2005年，Redman等［45］在水稻植株内分离的Fusarium culmorum和Curvularia protuberata能提高水稻耐盐性。缑小媛［46］于2007年研究证明了醉马草内生真菌（真菌类型未注明）可以促进NaCl胁迫下醉马草种子的萌发，以及调节植株的生长和生理，提高了醉马草的耐盐性。2009年，王正凤［47］发现野大麦内生真菌（真菌类型未注明）可以提高野大麦在盐胁迫条件下的发芽率、分藥数和生物量等。2010年，Mastouri等［48］研究表明哈茨木霉T22菌株可以诱导植物对氧化损伤的生理保护来提高幼苗活力和改善胁迫影响。2011年，Khan等［49］从大豆根中分离出小型青霉LHL09，该菌可以通过影响植物激素和黄酮类化合物的生物合成，从而改善盐胁迫的不利影响，促进了大豆植株的生长。2012年，Maciá-Vicente等［14］在小麦植株中分离得到固氮螺菌，发现盐胁迫下其与小麦之间存在共生关系，能促进小麦的生长，并影响小麦幼苗的水分吸收、光合色素含量和脯氨酸积累。钮旭光等［50］和范黎［51］从翅碱蓬中筛选出能促进盐胁迫下植物种子萌发和幼苗生长的内生真菌。2014年，陈亚平［52］从骆驼刺中分离出Phaeosphaeriopsis属真菌，从苦豆子和减蓬中分离出Phoma属真菌，以及在芦苇中分离到枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides），并在200 mmol/L NaCl条件下与水稻共培养，发现能增加水稻耐盐性。2017年，候姣姣等［53］在盐胁迫条件下分别用哈茨木霉（Trichodermaspp.）、丝核菌（Rhizoctoniaspp.）、黑附球菌（Epicoccumspp.）、曲霉菌（Aspergillusspp.）菌液灌根处理国槐幼苗，发现其抗盐能力提高。2018年，吴曰福等［54］在碱蓬根部分离得到耐盐内生真菌40株，有未被报道过的耐盐真菌Aspergillus aculeatus和Fusarium oxysporum，还有3株Aspergillus sydowii嗜盐真菌。

3 内生真菌对植物耐盐性提高的影响

3.1 稳定植物营养元素吸收和保持离子平衡

盐胁迫严重影响植物的生理过程，产生离子胁迫和渗透胁迫而使细胞抑制生长或死亡，最终导致植物生长受抑制或者死亡［55-56］。盐胁迫条件下的离子胁迫主要是Na+和Cl-浓度升高，以及平衡植物体内的P和S的减少。Na+和K+在盐渍土壤中是竞争关系，内生真菌与植物共生可以改变植物体内Na+和K+比值，改善由于盐胁迫造成的植物离子不平衡现象。Pereira等［57］对盐胁迫条件下的向日葵幼苗接种丛枝菌根真菌和细菌的混合物，发现植株各项指标均提高，组织中K+、Mg2+、Ca2+、N和P的含量积累，Na+的含量降低。将丛枝真菌与内生细菌混合接种于金合欢，也是相同结果［58］。Abdelaziz等［59］研究发现，盐胁迫条件下将梨形孢回接拟南芥后，Na+/K+比值降低，钾转运蛋白1（HKT1）和钾离子内流相关基因kt1、kt2的转录水平升高，推测内生真菌提高植物耐盐性的机制可能是通过调节Na+和K+离子通道的相关基因的表达水平，从而使盐胁迫条件Na+/K+的离子稳态达到平衡。

盐胁迫使植物养分吸收或运输减少，造成植物养分不平衡［60］。盐胁迫条件下接种丛枝菌根真菌，其菌丝生长能增加植物根部吸收水分和养分的面积，有利植物对水分和矿质元素的吸收，如P的吸收等［61］。除丛枝真菌外，盐胁迫条件下回接印度梨形孢，也可以显著提高植物对P的吸收量，从而增加植物生物量的积累［52］。另外，盐胁迫条件下接种内生真菌，还促进植物对N的吸收。Qin等［62］将植物内生真菌与植物共培养发现，提供有机氮源时，大多数内生真菌能将有机氮转化为无机氮，促进植物生长，提高植物生物量。

3.2 提高植物渗透调节能力

在盐胁迫条件下，植物体因大量失水进而导致渗透胁迫发生，植物通过积累有机物、减小渗透势、增强细胞渗透调节来适应环境变化［63-64］，生成并积累一些渗透调节物质，像氨基酸、蛋白质、甜菜碱和多胺等［65］。研究发现内生真菌可以通过调节植物脯氨酸、甜菜碱和可溶性糖等的积累来进行渗透调节，提高植物的耐盐性。Jindal等［66］在12.5和25 mmol/L NaCl条件下回接丛枝真菌，发现植物内脯氨酸含量增高。任安芝等［67］研究发现在高盐浓度下，丛枝真菌侵染可导致黑麦草叶片内的脯氨酸含量显著增加，可溶性糖含量显著降低。但付艳平等［68］用促生菌UW4悬浮液浸泡向日葵种子在盐胁迫下进行种植，发现其脯氨酸含量降低，可溶性糖含量增加。Al-Garni［69］在盐胁迫下回接丛枝真菌，发现回接植物中甜菜碱的含量增加，是未回接植物的2倍。因此，盐胁迫条件下，植物内生真菌对植物各渗透物质的调节作用受盐浓度、植物种类、环境等因素的影响，但各因素之间相互作用的机制不明，还需要进一步探究［70］。

3.3 保持植物光合作用和水分利用效率

盐胁迫对植物光合作用的影响既有气孔和叶肉的扩散限制光合代谢，也有固碳酶减少使光合作用降低［71］以及多重胁迫叠加产生的氧化胁迫。盐胁迫还会加速叶绿素的降解、降低类囊体膜稳定性、降低叶绿体对光能的吸收、影响光能在2个光系统之间的合理分配，最终导致光合速率的降低［72］。生长在盐渍化土壤的植物面临着生理干旱的危险，因此，它们必须保持较低的内部渗透力，以防止水从根部进入土壤，水分对于盐胁迫下的植物生长至关重要。盐胁迫下植物生长的恢复与碳平衡期间光合作用恢复的速度和程度有关，也与水分耗竭期间光合作用下降的程度和速度有关［60］，而接种内生真菌可促进植物提高光合速率和对水分的吸收效率，进而使植物减缓或抵御盐胁迫。

研究发现，无性型Epichloe内生真菌的侵染，可使大麦气孔发生变化并改变根系结构，从而增强水分利用效率［73］。Redman等［45］在盐胁迫条件下接种Fusarium culmorum和Curvularia protuberata两类真菌，减少了水稻20%-30%的耗水量，并提高了其生长速度和生物量。Azad等［74］研究表明，在NaCl胁迫条件下，接种内生真菌的植株比不接内生真菌植株有更高的水分利用效率和光合效率。Ghorbani等［75］在盐胁迫条件下接种印度梨形孢于番茄，发现印度梨形孢通过改善番茄水分状况和光合作用缓解盐胁迫。

3.4 增强植物抗氧化防御系统

盐胁迫导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生，而活性氧造成植物膜质过氧化进而影响植物生长［76］。但植物体内有ROS酶类保护系统，包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、 过 氧 化 物 酶（Peroxidase，POD）、 过 氧化氢酶（Catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GRX）、脱氢抗坏血酸酶（Dehydroascorbate reductase，DNAR）、 单 脱 氢抗坏血酸酶（Dehydroascorbate reductase，MDHAR）等［77］和非酶类系统（包括抗坏血酸（Ascorbic acid，ASA）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、类胡萝卜素、生育酚、类黄酮和甘露醇等，可以减缓或者避免活性氧对植物造成的损伤［77-78］。

研究表明，植物可通过接种内生真菌来清除ROS；通过增强抗氧化酶活性来加强菌根化，进而减少了氧化；积累还原的抗坏血酸和谷胱甘肽改善氧化还原稳定性，增强植物耐盐性进而增加植物生物量［79］。王英男等［80］在盐胁迫条件下的羊草内接种AMF真菌发现，抗氧化酶类的活性明显提高，氧自由基的清除能力增强。另外，Mastouri等［48］在盐胁迫条件下接种哈茨木霉T22菌株，发现该菌株能诱导植物接种AMF后宿主植物体内对氧化损伤的生理保护来提高幼苗活力。Pan等［44］在盐胁迫下将从碱蓬中分离的暗隔内生真菌回接杨树，发现显著增强了杨树体内抗氧化酶活性，提高了杨树耐盐性。Baltruschat等［81］发现在NaCl胁迫条件下接种梨形孢于大麦（Hordeum vulgare），显著提高了大麦抗坏血酸的含量，增加了根中抗氧化酶的活性。

另外，付艳平［68］用促生菌UW4悬浮液浸泡向日葵种子，在盐胁迫下进行种植发现，其可溶性蛋白增加。张爱娣等［82］在不同NaCl浓度下回接丛枝真菌到大叶女贞，发现其丙二醛含量相较于对照组明显降低，王娜等［83］在不同NaCl浓度下回接丛枝真菌到紫花苜蓿也有相同发现。

3.5 影响植物代谢中心和真菌分泌物质

盐胁迫会使植物体内的激素水平发生变化，如乙烯的积累，生长素、细胞分裂素合成的减少［52，56］。植物内生真菌能够刺激植物产生激素，如IAA、吲哚乙腈、细胞激动素等。硝酸担子菌（Piriformospora indica）就能刺激植物分泌生长素（如吲哚乙酸），从而促进植物生长［84］。很多学者认为内生真菌增强植物对环境胁迫的适应性是通过影响植物代谢实现的。Ghaffari等［85］分析发现植物根部被印度梨形孢侵染后，植物耐盐性得到了提高，并提出可能与糖代谢、氮代谢和乙烯合成途径有关。有学者提出内生真菌镰刀菌可以通过抑制植物体内的乙烯信号途径从而提高植物生长活力［15，86］。另外，禾草内生真菌能通过自身产生的次生代谢物保护植物，使其免受外界环境胁迫的危害［87-88］。有些内生真菌也能通过活化硝酸还原酶、分泌铁载体和磷酸酶等形式促进植物养分吸收，促进植物生长［15，89-93］，还能通过分泌粘液物质（多糖类），并在根表面形成菌膜来协助植物抗盐［15］。

3.6 诱导相关基因表达

植物体已进化成能通过多种生理生化方式来响应盐胁迫，而这些方式的形成离不开相关基因的调节。一方面相关基因参与植物-微生物共生体系建立，苜蓿中MtDMI3基因［15，94］和禾草植物内生真菌的Nox基因［15，95］参与植物-微生物共生体系的建立；日本百脉根（Lotus japonicus）质体蛋白基因（CASTOR和POLLUX）和编码核孔蛋白的基因NUP85［15，96-97］以及拟南芥 At5g16590 蛋白能协助真菌侵染植物根部［15，98］；另一方面，植物内生真菌可以通过与植物共生来诱导植物相关耐盐基因表达来抵御盐胁迫。惠非琼等［99］在盐胁迫下回接印度梨形孢于烟草发现，印度梨形孢能诱导烟草中耐盐相关基因DP8P1、PR-1a、PR2、PR3和PR5的大量表达，增强烟草耐盐防御机制，提高其耐盐性。李亮等［100］在盐胁迫下用印度梨形孢侵染紫花苜蓿根部发现，印度梨形孢可诱导脯氨酸合成酶基因P5CS表达进而增强紫花苜蓿的耐盐性。盐胁迫条件下，Ghaffari等［85］回接印度梨形孢于小麦，在小麦根部发现254个差异表达基因。

研究报道，菌根植物耐盐性与水孔蛋白的分子机理有关，植物内生真菌侵染植物后诱导了水孔蛋白基因的表达。Ouziad等［101］研究发现，NaCl胁迫下丛枝菌根真菌定殖的番茄中的Na+/H+转运蛋白和水通道蛋白基因表达。通过Northern分析和原位杂交发现，盐胁迫下用AMF定殖番茄根后两种Na+/H+转运蛋白基因（水孔蛋白基因LeTIP1和其他LePIP）表达上调，液泡膜和质膜水通道蛋白基因的转录水平升高。Aroca等［102］在盐胁迫下回接丛枝真菌于菜豆和番茄，也发现了质膜水通道基因表达量增加，LeTIP2表达量下降，质膜水通道蛋白（PIP1）的增加。综上所述，盐胁迫下内生真菌对不同植物的基因有不同的诱导功能和调控作用，而且不同植物内生真菌提高植物耐盐性的能力存在差异性，因此，挖掘促进植物耐盐性的内生真菌具有重要意义。

4 总结与展望

内生真菌可以从稳定植物营养元素吸收和保持离子平衡、提高植物渗透调节能力、保持植物光合作用和水分利用效率、增强植物抗氧化防御系统、产生次生代谢物或调节信号转导等方面来保护宿主植物，减轻盐害。内生真菌极有可能成为减轻植物盐碱胁迫一个有力工具，因此，专家预测内生真菌生物技术与传统的抗逆育种和转基因抗逆育种在未来将并驾齐驱［15］。目前，内生真菌被广泛运用在增强菌根植物（尤其是禾本科植物）耐盐性方面［103］，内生真菌提高非菌根植物耐盐性的报道也越来越多。虽然如此，运用内生真菌增强植物耐盐性的研究还有许多方面需要深入探讨。

在植物内生真菌分离方面：植物内生真菌种类众多，但可分离培养的只占总内生真菌的极小部分，植物体内还有许多不能分离但能显著提高宿主植物耐盐性的内生真菌有待挖掘。需要筛选适宜的培养基，不断更新优化培养基成分和配比。还需要比较不同分离方式对植物内生真菌多样性的影响，并筛选出最适合分离内生真菌的方法。另外，无论采用组织贴片或者研磨法进行植物内生真菌分离时，将分离基数加大（每个处理的贴片至少50片），以减少内生真菌分离的偶然性。除此之外，内生真菌分布具有一定组织特异性，需要研究者分离内生真菌时细化植物分离部位以获得更多目标内生真菌。最后，目前报道大多都关注植物体内生真菌优势种群研究，但一些起重要作用的非优势菌种或者与优势菌株共同起促生作用的非优势菌种也有待研究。

在盐胁迫下植物内生真菌对宿主植物耐盐性促进机制方面还有待进一步深化。首先，内生真菌协助植物抵御极端环境的假说有三种：即适应性生态位共生、共生态调节、共生体生活方式转化，但这些假说都是通过观察植物生长情况或者接种实验来验证，深层次的机理研究很少［15］。其次，植物内生真菌协助宿主抵御胁迫的能力受到宿主种类、宿主基因型和环境等因素的影响，较为复杂［104-106］。再次，关于植物内生真菌与宿主共生提高植物耐盐性的研究多局限于菌根植物。因为菌根真菌侵染宿主后，能使植物产生抗逆性，而非菌根植物内生真菌侵染后不稳定，而且侵染率极低。最后，内生真菌的发现及其次生代谢产物的产生，内生真菌与宿主互作的耐盐信号传导网络与基因交互表达等都不清晰，应该采用现代组学技术深入研究植物-内生菌共生体响应盐胁迫的特异信号传导和代谢途径［107］。总之，内生真菌在促进植物抗盐作用方面有着广阔的前景，单靠目前研究还远远不够。只有了解了内生真菌和宿主植物共生机制，才能将植物内生真菌减缓植物盐害作用运用到环境治理和农业生产中。