肠上皮下肌成纤维细胞与肠型胃癌相关性的回顾性分析＊

翟真真，王 乐，尚延生，刘 娜，尚淑平，朱黎英，周连泉

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，既往认为胃癌的发生是上皮细胞基因结构及表型的改变所致。 胃癌组织中间质所占比例呈明显增高趋势，研究显示［1］：肌成纤维细胞可分泌多种生长因子，在细胞的增殖、分化、凋亡等方面发挥调节作用，并参与肿瘤的形成。 胃的肠上皮下肌成纤维细胞（intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs）作为合胞体存在于上皮下，延伸到整个固有层。 胃的腺体位于ISEMFs 形成的保护性孔鞘中［2］。 肠上皮下肌成纤维细胞（ISEMFs）与胃癌的关系及其在胃癌发生中的作用国内少有报道。 笔者通过对临床肠型胃癌病例进行回顾性分析， 采用α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体对肠型胃癌患者和非萎缩性胃炎患者胃黏膜病理组织标本进行免疫组织化学染色，观察肠型胃癌胃黏膜组织中ISEMF 的表达及分布情况，对ISEMF 与胃癌的关系进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取德州市人民医院病理科2014年10 月—2016 年8 月病理确诊为非萎缩性胃炎的胃镜活检标本30 例（设为对照组），其中男17 例，女13 例，平均年龄53．32 岁。 病理确诊为肠型胃癌标本45 例（设为肠型胃癌组），其中男24 例，女21例，平均年龄56．32 岁。所有病理均经2 位以上高年资病理医师共同复合诊断。

1.2 免疫组织化学染色 胃癌标本及对照组胃黏膜标本10%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm 切片，用于HE 染色及免疫组织化学染色。兔抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体 （α-SMA），抗体货号：EPR5368，购于美国abcam 公司；PV6000二步法免疫组化检测试剂盒、DAB 试剂盒等， 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 免疫组化染色采用SP 二步法， 石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，经抗原修复后，滴加一抗（1∶1000），以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。4 ℃孵育过夜。滴加生物素标记的羊抗兔二抗和辣根过氧化氢酶，DAB 显色，自来水冲洗，苏木精复染，封片。

1.3 结果判定 利用专业图像分析软件对所有摄取的图像进行分析。 选取200 倍视野观察整张切片，计数每份标本。 α-SMA 染色后胞质中出现背景清晰的棕色或棕黄色颗粒为阳性细胞，检测具有代表性的5 个高倍视野内ISEMF 的个数，计算其平均值，用表示。

1.4 统计分析 采用SPSS 22．0（for windows）统计软件对所得数据进行分析。 资料组间差异比较采用方差分析，所有计量数据以形式表示。 取P＜0．05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

非萎缩性胃炎黏膜中ISEMF 的分布与表达：在非萎缩性胃炎黏膜标本中，ISEMF 在正常胃黏膜中表达阳性率低且呈弱阳性，散在分布于腺体间（图1）； 在肠型胃癌标本中ISEMF 的分布与表达：α-SMA 阳性细胞染色强度增强， 在癌巢间呈现无规律的小片状分布，不在腺体周围分布（图2）；正常对照组每高倍视野ISEMF 为（43．4±6．5）个，肠型胃癌组为（72．3±8．2）个，肠型胃癌组明显高于对照组（P＜0．05）。ISEMF 分布及表达在非萎缩性胃炎黏膜与肠型胃癌组织中存在明显差异，在肠型胃癌黏膜间质中有增多的趋势。

图1 α-SMA 标记的肠上皮下肌纤维母细胞在正常胃黏膜中的表达（α-SMA，×200）

图2 α-SMA 阳性细胞在肠型胃癌癌巢间呈无规律的片状分布（α-SMA，×200）

3 讨 论

Cajal 间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）和肠上皮下肌成纤维细胞 （intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs）是肌成纤维细胞主要组成成员。 目前研究表明，肌成纤维细胞组成了一个旁分泌家族，在细胞的增殖、凋亡、组织修复及炎症免疫等方面发挥重要的调节作用［3］。 其中ISEMFs 是位于消化道及消化腺上皮细胞与固有膜之间的肌成纤维细胞， 其存在于食管到肛门的消化道以及胆囊、胰腺的黏膜上皮下［4］，ISEMFs 主要分子标志物是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）［5］。 目前对ISEMFs研究和报道最多的是在小肠和结肠中［3］，在肠道中ISEMF 分泌ANGPTL2 通过调节骨形态发生蛋白（BMP）和β-连环蛋白（β-catenin ）之间竞争信号的水平来维持肠干细胞龛，对于调节肠道内的干性和上皮伤口愈合具有重要意义［6］，并且其在促进黏膜生长发育、参与大肠肿瘤形成及转归等方面作用明显［7］。

ISEMF 在胃部疾病中相关研究较少，胃的肠上皮下肌成纤维细胞是作为合胞体存在于上皮下，并且延伸到整个固有层，在上皮间质转化中发挥着非常重要的作用。 胃的腺体位于ISEMFs 形成的保护性孔鞘中［2］。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，尽管数据显示胃癌的发生率有所下降，但其仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一。 我国是胃癌高发国，根据2018 年发布的《中国肿瘤登记年报，2014》［8］，胃癌发病率居我国恶性肿瘤的第二位，病死率居第三位， 新发病例及死亡病例约占消化道恶性肿瘤的40%。 既往认为其发生是上皮细胞基因结构的改变和表型改变，间质细胞仅发挥被动作用。 但近些年研究发现间质在肿瘤的形成、分化及进展过程中同样发挥着必不可少的作用。 上皮间质转化、间质上皮转化在肿瘤的浸润、转移等过程中有着重要的作用。目前研究表明［9，10］，胃的ISEMF 可以分泌肝细胞生长因子、 角细胞生长因子和TGF-β 等多种生长因子，进而调节上皮细胞的分化，ISEMFs 在细胞的分化、增殖和凋亡等方面发挥调节作用，参与肿瘤的形成、组织修复等过程。

该研究应用免疫组化的方法检测分析肠上皮下肌成纤维细胞（ISEMF） 在胃黏膜中的表达及分布。 结果显示：在正常胃黏膜组织中，肠上皮下肌成纤维细胞中表达阳性率低且均为弱阳性，散在分布于腺体中间；这与正常大肠黏膜中的分布在上皮基底部不同［11］。 在肠型胃癌中肠上皮下肌成纤维细胞表达阳性率高，在肿瘤组织间呈无规律的小片状分布。 α-SMA 阳性慢性胃炎对照组每高倍视野ISEMF 为（43．4±6．5）个，在肠型胃癌组每高倍视野ISEMF 为（72．3±8．2）个，两组具有统计学差异。

该研究结果表明，肠上皮下肌成纤维细胞在胃癌和正常胃黏膜中既存在数量的改变，也存在分布模式和位置的变化。 胃癌α-SMA 表达较正常胃黏膜表达增多，且表达模式改变，无规律地分布于肿瘤病变中，提示肠上皮下肌成纤维细胞的分布与胃癌的发生有一定关系，其相互作用及具体机制有待于进一步研究。