应用重组发光细菌评价水中环境污染物毒性的研究进展

曾祺雯

（福州大学，福州 351008）

1 水污染及污染物毒性检测

1.1 污染现状

过去，我国采用低经济成本、高环境成本的发展模式，导致环境污染问题日益加重，环境污染物毒性对水体中生物的生存以及人类安全造成了巨大的影响。目前，我国重金属及有机污染物污染严重，以宁波市为例，宁波市地表水中重金属Cd、Cr、Pb 含量均超过国家标准。2017年，我国各监测点水质监测的评价结果显示：水质为优良级、良好级、较好级、较差级和极差级的监测点分别占8.8%、23.1%、1.5%、51.8%和14.8%。主要超标指标为总硬度、锰、铁、溶解性总固体、“三氮”（亚硝酸盐氮、氨氮和硝酸盐氮）、硫酸盐、氟化物、氯化物等，个别监测点存在砷、六价铬、铅和汞等重金属超标现象。同时，我国在水污染治理过程中还存在水污染治理政策管理机制的缺乏以及水污染治理技术亟待提高等问题。为改善高污染、高消耗的现状，实现可持续经济发展，我国现今有必要改进污染物毒性的监测手段，毒性监测技术逐渐成为一种新兴的发展趋势。

1.2 传统的污染物毒性检测技术及其优缺点

毒性一般分成急性生物毒性和慢性生物毒性。传统化学方法可以定量检测水中毒性物质含量，但无法检测有毒物质对生物体和环境的综合毒性。在衡量毒性对生态系统的危害时，采用生物可利用性作为指标可以更好地反映其风险影响。然而，传统水生生物检测方法（如鱼类、原生动物等）虽然可以反映生物影响，但试验过程冗杂、周期长，不适于急性毒性检测。

2 基于重组发光细菌的水质毒性检测

2.1 天然发光细菌毒性检测的机理及优缺点

天然发光细菌检测由于检测速度快、成本低、敏感度高、发光强度易观察等优点，被广泛应用于水质急性毒性检测中。其发光机理如下：细胞在正常生理状况下，利用还原型黄素单核苷酸（FMNH2）、长链脂肪醛（RCHO）为底物，在氧与细菌荧光素酶的参与下，进行发光反应（可见光波长420～670 nm），具体如下。

目前，国内外应用于水质检测的天然发光细菌一般为费氏弧菌、明亮发光杆菌等，国内发现了世界上唯一一株无致病性淡水发光细菌——青海弧菌。国际上针对天然发光细菌的毒性检测研发了各类自动在线毒性检测仪，如Microtox®CTM（Modern Water，英国）和iTOXcontrol®（micro LAN，荷兰）。但是，目前标准方法（如Microtox®）采用的V.f ischeri和P.phosphoreum都是海洋细菌，每次测定之前都必须进行过滤，并提高盐度使其在海洋环境中检测。而盐度提高，一些有机物的溶解度降低，导致溶液浑浊。所以，天然发光细菌毒性检测方法对于淡水毒性检测缺乏一定的代表性，对于预测废水对活性污泥的毒性缺乏准确性，并且无法特异性识别不同种类的污染物。与此同时，不同种类的发光细菌对不同毒性物质的敏感性不同。

2.2 重组发光细菌优势以及常用发光基因介绍

由于天然发光细菌并不能识别水中污染物的具体类别，近年来国内外开始构建各类可以进行特异性识别污染物的重组发光细菌。由于大肠杆菌生长速度很快，以大肠杆菌作为宿主细胞、以发光基因作为报告基因的重组发光细菌，能够适应淡水或污水处理厂中的环境并对不同的毒性物质有所响应，由此可进行灵敏、准确、全面的污染物毒性检测，为进一步分析水质安全提供依据。

重组发光细菌中常用的报告基因是萤火虫荧光素酶（luc），细菌荧光素酶（lux）（来源于哈氏弧菌、明亮发光杆菌以及费氏弧菌）和绿色荧光蛋白（gfp）（源自Jellyfish Aequorea Victoria）。gfp具有相对高的背景信号，但其荧光强度非线性，定量困难且紫外激发对GFP 有光漂白和破坏作用，导致荧光快速消失。luc或luxAB需要额外的发光物质，在基于luc和lux的传感器之间没有发现显著的发光最大值。尽管luxCDABE较大，但由于自身的方便性和灵敏性，其仍然经常被用作报告基因。lux作为生物报告器的首次使用由Enbreghet 完成。1987年，Rogowsky 等人使用无启动子luxCDABE构建了广谱宿主范围的pUCD615 载体，广泛用于重组发光细菌构建中。

2.3 重组发光细菌类型机制

根据重组发光细菌的发光基因表达机制，人们通常将其分为组成型和诱导型。

组成型通常利用强启动子，使报告基因（如luxABCDE）在正常条件下高效表达；而在有毒有害条件下，表达水平将降低，其降低水平可测量且与样本的毒性相关。因此，组成型表达系统中，任何降低细胞生长速率或导致细胞毒性的物质都会导致报告信号强度的降低。然而，该系统只能显示总毒性结果，无法检验特异性毒性。另外，该系统在某些化合物或诱导物的作用下可能导致应激反应的增加[1]。国际上，对于此类细菌的研究已达30 余年，该类细菌能够对水体的总毒性进行检测，其检测结果对水质安全有着较大意义。迄今已构建了很多适用于不同环境的组成型发光细菌，虽然其发光光强较为稳定，但其灵敏性仍普遍比天然发光细菌差，因此还不能代替天然发光细菌成为标准方法中应用的细菌。

诱导型重组发光细菌，基于发光细菌对不同有毒物质的敏感性不同。在构建重组菌时，将报告基因与降解途径结合，即在报告基因上导入特殊应激启动子（调控相关蛋白的基因如recA、fabA、katG等）。由于调控蛋白的存在，此类重组菌在正常情况下，P/O 区受到阻遏，发光基因的表达受到抑制，菌株不发光或发光微弱；只有当特殊毒性（既可以是某类毒性损失机制如DNA 损伤、膜损伤和蛋白质损伤等，也可以是某种物质如重金属、有机污染物等）存在时，该毒性与对应的调控蛋白结合，解除对P/O 的阻遏，发光基因得到表达，即菌株被该毒性诱导发光。当该毒性浓度增大时，诱导产生的光强相应增大。但当毒性浓度过大时，其阻碍了细菌的新陈代谢途径，导致发光光强减弱。诱导系统提供了组成系统缺乏的特异性，可以定向针对某类或某个污染物进行检测；但是，由于其特异性，在没有特异诱导物的情况下，即使存在其他潜在有害或严重的化合物，系统也可能没有反应。由于启动子的特异性，许多启动子和报告基因的组合已被用于各种诱导型重组菌。利用传统方法对启动子的研究耗时耗力，目前借助计算机辅助DNA 和蛋白质微阵列技术，特异性启动子的筛选效率有望 提高。

3 重组发光细菌技术应用研究进展

3.1 重组发光细菌的构建的研究进展

近年来，国内（见表1）、国外（见表2、表3）构建了各种类型的重组发光细菌，对应检测不同的毒性响应机制或者不同的目标污染物。鉴于诱导型重组菌的特异性毒性识别特征，国内外所构建的大部分为诱导型重组细菌。

国外机构的重组发光细菌的构建研究较为全面、完善，构建的重组菌可以对化学有机物、重金属污染物等进行特异性检测（见表2、表3），部分重组发光细菌已被制成传感器，可进行实际的研究操作。韩国的Gwangju Institute of Science and Technology（GIST）机构，对诱导型重组发光细菌的研究构建了应激氧化损伤、DNA 损伤、膜损伤和蛋白质损伤几大类的诱导型细菌[2]。由于该发光细菌可以对毒性性质进行区别，其结果对指导污水处理厂运行和调查毒性事件的毒性源有较大的意义。

我国在重组发光细菌方面的研究起步时间相对国外较晚（见表1），还存在较大的发展空间。清华大学的何苗课题组对重组发光细菌的构建有深入的研究，主要以luxCDABE为报告基因构建各类重组发光细菌，进行不同毒性响应机制和传感器的研究。国内对于重组发光细菌的研究还表现在对青海弧菌的发光基因的探索上[3]。

表1 国内重组发光细菌的研究现状

表2 国外重组发光细菌的研究现状（化学有机物）

表3 国外重组发光细菌的研究现状（金属）

3.2 基于重组发光细菌的传感器的研究进展

基于天然发光细菌和重组发光细菌的一致荧光信号，两者可用相同的荧光探头采集信号，均可在同一套仪器检测系统中使用。天然发光细菌毒性检测方法反映了水体的急性综合毒性，目前已经能成功检测重金属等无机污染物和各类化学有机污染物。

虽然对于发光细菌毒性检测的研究已经有了很多的成果，通过构建新种类的细菌也使得该方法，能在更广泛的环境下进行检测，同时能检测出更多种类的毒性物质,但是标准方法中应用的检测方法不能够实现在线连续检测，同时也不能进行实验现场检测。因此，将生物敏感元件与信号传导器相结合，形成了生物传感器，其特有的使用简单、快速响应和在线监测的适应性让其有更大的发展前景。天然发光细菌以及重组发光细菌均能在实验室里获得良好的检验结果，然而直接在野外检测时使用报告菌株会受到许多限制。因此，利用生物芯片技术可以通过生物、化学、光学等方法，整合生物感应原件和信号的生产与转化过程，应用于芯片中，便于携带。同时，将报告菌株固定于特定材料上，这样既可以保持其活性，又可以转换放大各类信号，使得后续操作更加简便[4]。目前，国内一些研究中将发光细菌固定于混合纤维膜上，或者包埋于海藻酸钠凝胶中，与硅光片相接从而输出电信号。

为了能够准确检测实际水样的毒性，目前发光细菌传感器的研究主要集中在以下两个方面：现场在线连续检测、便携式系统。在这两个方面研究中，同时都注意了利用多种发光细菌进行检测，这样能够得到更全面和准确的结果。

3.2.1 在线自动检测

水体生物毒性的实时监控对于水质监控和废水处理非常重要，因此具有自动化和远程实时监控优势的在线毒性检测得到了广泛重视和研究。在线毒性检测可以在固定地点，自动地提供连续的水体毒性数据，作为水体毒性监控的工具有很大的潜力。

目前，人们已经研发出将发光细菌固定在琼脂糖或者经冷冻干燥后将其固定在微孔板上的毒性监测仪，然而这样的监测仪存在许多弊端。由于许多具有不同化学结构的化合物可能具有相同的生物毒性作用，精确度低，易产生试验误差。此外，所有这些技术都需要操作熟练的技术人员和昂贵的设备；设备运行复杂并且结果可能需要数天才能获得。因此，近年来，国内外开发了一些具有实时检测能力的操作简单、成本低廉的便携式在线监测系统。

Evgeni Eltzov 等研究调整了几种影响传感器性能的工程参数，设计的含纤维测量单元的结构降低了剪切应力，从而防止其降解[5]。因此，这种系统允许在更短的时间内测试更大体积的样品的更高流速，从而提高测量的持续时间，并增加了灵敏度。

汪用志等研发了基于重组发光细菌的重金属生物毒性自动在线监测仪，仪器系统可以自动稳定运行3d[6]。在此基础上，又设计开发了二维生物毒性自动在线监测仪，同时使用天然发光细菌中的费氏弧菌Vibrio f ischeri和对重金属汞有特异性响应的重组发光细菌pTHE30-E.Coli进行水质测定，联合检测水样的重金属生物毒性和水质急性综合毒性。

3.2.2 便携式系统

除了在线监测水体毒性之外，为了能够进行野外现场随机分布采样点的即时检测和大批量样品的检测，人们研制了一些微型化集成检测系统，使得传感器结构更加紧凑和小巧。一个便携式的发光细菌传感器必须满足以下几个要求：传感细菌必须在储存和运输到现场的过程中不丧失活性；该系统检测必须具有较短的检测时间；在检测结构中对毒性响应产生的生物发光与环境中的光之间的互相影响必须最小化；对于缺少预处理的真实样品检测，这个便携式传感器的操作必须简单。

于海等研究优化了一种监测水中污染物急性毒性的生物传感器，该传感器采用固定了明亮发光杆菌的光纤探头[7]。优化后的传感器检测了Zn2+、NH3+、硝基苯和甲酚等4 种水中典型污染物的剂量-效应曲线，并通过计算确定了其EC50。该传感器经过比较试验后证明其与标准法具有良好相关性，能反映水中污染物的总毒性。

Evgeni Eltzov 等研制并优化了一种新型的液体光波导细菌生物传感器，用于测定水中有毒污染物的存在。该系统主要由以下几个部分组成：一个非一次性的液体光波导、PMT 探头和固定在在海藻酸钙片基质中的发光细菌。该传感器可以在非常低的样本容量下对水化学物质进行敏感和便携的量化，可以针对世界欠发达地区进行水质分析[8]。

3.3 检测条件优化（假阴性问题）的研究进展

细胞的培养过程中，由于细胞暴露于致命浓度的有毒化合物下，营养物质的不均匀分布，或抑制性化合物的存在等情况下，细胞可能丧失活性而死亡。此时无法检测到信号，致使结果出现误差，生物发光测试可能导致假阴性。目前，已经提出了几种抵消这个问题的方法。例如，在组成型表达生物传感器中，基线水平表达的下降即可表明生物转运蛋白被抑制或失活。

汪用志等尝试应用内标法来避免误报问题，研究发现，在实际水样测试中，使用额外目标物质的平行测试适用于估计水样的细胞毒性并且能够避免假阴性干扰[6]。该研究中的重组发光菌株可用于灵敏、特异地测定水样中Hg2+的生物利用度。干扰物质如镉的影响有限，误报问题得到控制。为了避免假阴性问题，在带有额外汞的平行测试中使用内标法，其不仅容易操作，而且有助于识别假阴性样本。

4 基于重组发光细菌毒性监测的发展趋势

为完善重组发光细菌的毒性监测方法，提高数据的准确度，近年来出现了各类改进方法。针对目前发光细菌急性毒性标准测试方法中存在的准确度问题，通过优化改良实验条件以及操作步骤，增加发光自然变化因子和原始发光光强2 个参数，减少了稳定性误差与手工加样误差。以Fabonacci 法进一步优化改进基于Windows 和Android 平台开发的曲线拟合模型的各项系数，编写了毒性物质成分和浓度预测的远程在线水质生物毒性预测软件[9]。算法对磁力搅拌时间、培养温度、暴露时间及pH 值范围对EC50 测定值的影响进行分析，加强了精确度和稳定性。

目前，重组发光细菌的在线监测技术的发展趋势主要有：构建针对不同污染物或污染机制的特异性重组发光细菌；提高重组菌的灵敏度、稳定性，避免假阴性；优化传感器性能；对不同类别、性质水域水体进行在线检测仪器的功能优化；提高数据精确度和可信度。

5 结论

随着水中有毒物质的毒性危害逐渐被人们所认识，水中毒性的检测也越来越被人们所重视。但是，标准的发光细菌检测方法不能满足特异性的在线检测、现场检测等要求。重组发光细菌毒性检测具有非常好的应用前景，其能够适应不同的检测环境，并且能够检测多种物质或多种类型的毒性。随着传感器的研制，其操作更加迅速和简便，可能大范围推广。但目前其检测结果的灵敏性略逊于标准方法，准确性也有待进一步提高。我国对重组发光细菌毒性检测的研究起步较晚，更需要尽快弥补此方向的空白，使其有望成为可以广泛应用的标准方法。