壮药透骨香对胶原诱导型关节炎大鼠的干预效果及作用机制▲

赖克道 王 丽 邓聿胤 吕纪华 刘 瑛 覃 良

(广西壮族自治区中医药研究院中药药理所/广西中药质量标准研究重点实验室，南宁市 530022，电子邮箱：215544910@qq.com)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以炎性滑膜炎为主要特征的慢性系统性疾病，病理表现为关节滑膜的慢性炎症和血管翳形成，其可引起关节的软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失[1-2]。目前，我国RA的发病率为0.32%～0.36%[3]，女性居多，临床主要表现为对称性的多关节疼痛、肿胀、功能下降，病程长且易反复发作，严重影响患者生活质量。透骨香为夹竹桃科植物筋藤的干燥根和茎，是广西民族药“五松肿痛酊”中的原料药材[4]，用于治疗RA引起的关节疼痛，疗效甚佳[5]。本文通过建立胶原诱导型关节炎 (collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探讨壮药透骨香的干预治疗作用及相关机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年无特定病原体级SD雌性大鼠70只，体重180～220 g，购自广西医科大学动物实验中心，许可证号为SCXK桂2009-0002。大鼠适应性饲养2周后用于实验，饲养环境：温度20℃～25℃、相对湿度(60±10)%，自由饮食。

1.2 主要药品与试剂 (1)透骨香水溶部位：透骨香药材采自广西玉林市，经本研究院饶伟源主任药师鉴定为夹竹桃科植物筋藤后使用。透骨香药材采用60%乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇后，药液进行梯度提取分离，得到水溶部位浸膏，每克浸膏含21.96 g生药，实验时以蒸馏水稀释成所需浓度使用。(2)牛源Ⅱ型胶原、不完全弗氏佐剂均购自Sigma公司(货号：C7806、F5506)，使用时将牛源Ⅱ型胶原溶于0.1M乙酸溶液中配制成2 mg/ml胶原溶液，4℃过夜后将等量的胶原溶液与不完全佛氏佐剂乳化制成混合乳剂。(3)雷公藤多苷片购自湖南千金协力药业有限公司(批号20171202)，水合氯醛购自成都市新都区木兰镇工业开发区(批号：2016092901)，大鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、大鼠白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自天津安诺瑞康生物技术有限公司(批号：569180611、370180611)。

1.3 主要实验仪器 超声波处理器(上海生析超声仪器有限公司)，TDL-5-A型低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，Multiskan GO型全波长全自动多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)，FSH-2A型可调高速匀浆机(金坛国旺实验仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备与分组：将70只大鼠按照数字随机表法分为空白组10只及CIA模型组60只。参照文献[6-7]，采用牛源Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂(1 ∶1)乳化制成的混合乳剂在模型组大鼠右后足趾、背部和尾根部分别进行皮下注射致炎，每个部位注射0.2 ml，空白组注射相同体积0.1M乙酸，造模14 d后继续加强免疫1次，各部位注射量0.1 ml。造模前后采用千分游标卡尺测量大鼠下肢足趾厚度，根据足趾肿胀度评价模型制备情况。造模21 d后将10只足趾肿胀度较轻(<0.5%)的模型组大鼠剔除，剩余50只按照数字随机表法分为模型组、雷公藤多苷组以及高、中、低剂量透骨香组，每组10只。

1.4.2 给药方法：各组大鼠于造模后21 d开始灌胃给药，雷公藤多苷剂量为0.01 g/kg，透骨香水溶部位高、中、低剂量分别为73.79 g生药/kg、36.89 g生药/kg、18.45 g生药/kg，灌胃量为1 ml/kg，空白组与模型组分别予以等体积蒸馏水灌胃，共给药28 d。

1.5 观测指标

1.5.1 足趾肿胀度：各组大鼠于造模前、造模21 d后及给药28 d后分别应用千分游标卡尺测量大鼠右下肢足趾厚度，按下列公式计算足趾肿胀度：肿胀度=(造模后足趾厚度—造模前足趾厚度)/造模前足趾厚度×100%。

1.5.2 关节炎指数：末次给药后，各组大鼠进行关节炎评分，采用关节炎指数(arthritis index，AI)积分法评定。关节病变按5 级分法评价[8]：无红斑肿胀为0分，踝关节和小趾关节出现红斑及轻微肿胀为1分，踝关节和足趾出现红斑及轻微肿胀为2分，踝关节与足爪出现红斑及中度肿胀为3分，踝关节与足爪有红斑及重度肿胀为4分。将四肢评分累加得到每只大鼠的AI，AI越高，关节症状越严重。

1.5.3 血清TNF-α、IL-1β水平：末次给药后，采用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉各组大鼠，腹主动脉采血，离心(3 000 r/min，10 min)后取血清，按照试剂盒说明采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平。

1.5.4 关节组织匀浆TNF-α、IL-1β水平：各组大鼠处死后，取部分踝关节韧带及关节囊组织，称重剪碎与生理盐水以1 ∶9比例制备10%关节组织匀浆，离心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，按照试剂盒说明采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模21 d后空白组及CIA模型组大鼠的足趾肿胀度比较 造模21 d后，CIA模型组的足趾肿胀度为(0.841±0.154)%，高于空白组的(0.070±0.052)%(t=6.733，P=0.012)。

2.2 给药28 d后6组大鼠的足趾肿胀度比较 给药28 d后，与空白组比较，模型组和各用药组大鼠足趾肿胀度升高(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组和高、中、低剂量透骨香组大鼠足趾肿胀度降低(P<0.05)；与雷公藤多苷组比较，低剂量透骨香组大鼠足趾肿胀度升高(P<0.05)，中、高剂量透骨香组差异无统计学意义(均P>0.05)；各剂量透骨香组之间比较差异亦无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 给药28 d后6组大鼠足趾肿胀度比较(x±s，%)

注：与空白组相比，★P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与雷公藤多苷组比较，*P<0.05。

2.3 6组大鼠的AI比较 与空白组比较，模型组大鼠AI升高(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组和高剂量透骨香组大鼠AI降低(均P<0.05)；与雷公藤多苷组比较，低、中剂量透骨香组大鼠AI升高(均P<0.05)，高剂量透骨香组AI差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量透骨香组AI低于低剂量透骨香组(P<0.05)。见表2。

表2 6组大鼠的AI比较(x±s，分)

注：与空白组相比，★P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与雷公藤多苷组比较，*P<0.05；与低剂量透骨香组比较，#P<0.05。

2.4 6组大鼠的血清TNF-α及IL-1β水平比较 与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组和中、高剂量透骨香组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)。见表3。

表3 6组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较(x±s，pg/ml)

注：与空白组相比，★P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

2.5 6组大鼠关节组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平比较 与空白组比较，模型组大鼠关节组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷片组和透骨香高剂量组大鼠关节组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)，透骨香中剂量组大鼠关节组织匀浆中TNF-α水平降低(P<0.05)。见表4。

表4 6组大鼠关节组织匀浆TNF-α、IL-1β水平比较(x±s，pg/ml)

注：与空白组相比，★P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

3 讨 论

壮医药是我国中医药和民族传统医药的重要组成部分，在防治RA方面具有独特疗效。RA属中医“痹证”范畴，壮医名为“滚克”，壮医学认为RA发病多由外受湿邪，阻滞脉络继而入骨，病久正气虚衰，气滞血瘀，从而引起谷道、水道、气道及龙路、火路阻滞，使天地人三气不能同步而致病[9-10]。RA的治疗应祛风除湿，消肿止痛，益气活血通络。透骨香为夹竹桃科植物筋藤的干燥根和茎，主要产于广西和广东，为广西民间壮药，具有祛风除湿、消肿止痛、祛腐生肌之功效，用于治疗风湿关节疼痛、跌打肿痛等疗效确切。本研究结果显示，造模21 d后，CIA模型大鼠足趾肿胀度显著升高，提示造模成功；灌胃给药28 d后，与模型组比较，高、中、低剂量透骨香组大鼠足趾肿胀度降低(P<0.05)，且高剂量透骨香组大鼠AI降低(P<0.05)，即不同剂量的透骨香水溶部位均可缓解CIA模型大鼠的关节症状，提示透骨香水溶部位对胶原诱导的RA大鼠具有干预治疗作用。此外，与雷公藤多苷组比较，低、中剂量透骨香组大鼠AI均升高(均P<0.05)，但高剂量透骨香组大鼠差异无统计学意义(P>0.05)，且高剂量透骨香组大鼠AI低于低剂量透骨香组(P<0.05)，提示高剂量的透骨香水溶部位缓解关节症状效果最佳。

RA的发病机制目前尚未完全明确，滑膜组织增生、炎性细胞浸润、骨及软骨降解与破坏及自身免疫等病理生理过程贯穿整个病程，它们之间相互作用、相互关联，形成一个错综复杂的网络，其中炎症细胞因子紊乱在RA发生及进展过程中发挥重要的作用[11]。TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌[12]，是机体炎症反应的重要调节因子。TNF-α参与了RA滑膜组织增生、炎症和自身免疫反应3个病理生理过程，是RA发病机制中处于中心地位的促炎症因子[13-14]。IL-1是参与RA进展期关节破坏的典型炎症细胞因子，主要来源于活化的巨噬细胞，可以由TNF-α产生或自身刺激产生，IL-1分为IL-1α和IL-1β两型，其中IL-1β为分泌型兴奋因子，能够促进自我分泌，从而将炎症信号迅速放大，影响RA 炎症过程[15]。研究表明，活动期RA患者血浆TNF-α、IL-1β水平明显升高，是RA炎症活动的重要衡量指标[16-17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清与关节组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平均升高(P<0.05)，符合RA的炎性改变；与模型组比较，中剂量透骨香组大鼠的血清TNF-α、IL-1β水平及关节组织匀浆中TNF-α水平均降低，高剂量透骨香组大鼠血清及关节组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)，即中、高剂量透骨香水溶部位均能降低CIA模型大鼠血清及关节组织匀浆TNF-α、IL-1β含量，提示透骨香水溶部位干预作用机制可能与调节炎症因子TNF-α、IL-1β的表达有关。

综上所述，壮药透骨香水溶部位对CIA大鼠具有干预治疗作用，且高剂量(73.79 g生药/kg)的透骨香水溶部位效果最佳，其作用机制可能与调节炎症因子TNF-α、IL-1β的表达有关。而透骨香水溶部位对其他炎症因子及免疫功能是否有影响，具体途径如何有待进一步深入研究。本研究为壮药透骨香抗RA作用提供了实验参考依据，为民族药五松肿痛酊的进一步开发应用奠定了基础。