不同14-3-3 zeta表达水平的胃癌伴腹膜转移患者临床病理特征及患者预后的影响因素

杨 乾 姚宏亮 范 洁 赵 鸣

(1 中南大学湘雅二医院胃肠外科，湖南省长沙市 410000，电子邮箱：bq9195@csu.edu.cn；2 湖南省湘潭市中心医院普外科，湘潭市 411100)

胃癌是我国最为常见的消化道恶性肿瘤，2015年中国胃癌新发病例约67.9万例，胃癌死亡病例约49.8万例[1]。我国的胃癌患者发现时多以进展期为主，术后复发转移是总体预后差的重要影响因素，其中腹膜转移是胃癌患者最常见的转移方式，约占50%以上，且该病缺乏有效的药物，治疗困难[2]。伴有腹膜转移的胃癌患者，中位生存期仅12个月左右。在ToGA试验中，人类表皮生长因子受体-2表达阳性的胃癌患者经赫赛汀(曲妥珠单抗)靶向治疗后生存期并无明显延长[3]。目前，临床尚缺乏有效的靶点药物用于治疗胃癌伴腹膜转移。本文分析胃癌伴腹膜转移患者原发病灶中14-3-3 zeta的表达与临床病理因素的关系，以及患者预后的影响因素，为进一步寻找胃癌伴腹膜转移患者的分子标志物以及治疗靶点提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取2010年1月至2016年12月在湖南省湘潭市中心医院就诊的76例胃癌伴有腹膜转移患者的胃癌组织所有病例的诊断均通过手术及病理证实。

1.2 主要试剂 兔抗人14-3-3 zeta多克隆抗体购自Abcam公司代理长沙维世尔生物科技有限公司(批号：ab51129)，驴抗兔二抗购自Thermo Fisher Scientific公司(批号：A-31572)，二氨基联苯胺辣根过氧化物酶显色试剂盒购自碧云天公司(批号：P0203)。

1.3 实验方法 将所有患者胃癌原发灶组织的蜡块进行切片，将石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ(静置10 min)、二甲苯Ⅱ(静置10 min)、1∶1二甲苯/酒精溶液(静置10 min)、100%酒精溶液(静置5 min)、95%酒精溶液(静置5 min)、75%酒精溶液(静置5 min)以及50%酒精(静置5 min)，然后使用磷酸缓冲盐(phosphate buffered saline，PBS)溶液洗涤3次，3 min/次。将石蜡切片置于乙二胺四乙酸缓冲液15 min修复抗原。每张切片加入适量的3%过氧化氢后室温孵育15 min，再次使用PBS溶液洗涤3次，3 min/次。(4)每张切片加适量的脱脂牛奶，孵育15 min，PBS溶液洗涤3次，3 min/次。每张切片加适量一抗，室温下孵育60 min或4℃过夜。将石蜡切片用PBS溶液冲洗3次，5 min/次。除去PBS溶液，每张切片加二抗，37℃孵育30 min。PBS溶液冲洗3次，3 min/次。每张切片加1滴新鲜配制的二氨基联苯胺，留置10 min进行显色。用自来水冲洗石蜡切片，苏木素复染(20～30 s)后，再用自来水冲洗，PBS溶液返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

1.4 结果判定 采用12分法进行免疫组化评分[4]。染色强度评分：阴性0分；弱1分；中等2分；强阳性3分。阳性细胞比例评分：<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。免疫组化评分=染色强度×阳性细胞比例。采用中分法对14-3-3 zeta表达情况进行分组，≤7分为14-3-3 zeta低表达，共49例，≥8分为14-3-3 zeta，共27例。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验；计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法；影响因素分析采用Cox回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 14-3-3 zeta低表达组和高表达组的临床病理特征比较 14-3-3 zeta低表达组和高表达组的年龄、性别、Boarrmann Ⅳ型及化疗病例比例比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，但两组的肿瘤位置、行姑息性胃切除术及印戒细胞癌者比例、腹水分级比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 14-3-3 zeta低表达组和高表达组的临床病理特征比较

注：腹水分级：无为<300 ml；少量为≥300 ml但<500 ml；中量为≥500 ml但≤3 000 ml；大量为>3 000 ml。

2.2 14-3-3 zeta低表达组和高表达组的预后比较 14-3-3 zeta低表达组的中位生存期为15.33个月，高于14-3-3 zeta高表达患者的7.97个月(χ2=8.025，P=0.005)，见图1。

2.3 行或未行姑息性胃切除术以及术前转化化疗患者的预后比较 行术前转化化疗患者的中位生存期为15.47个月，高于未行术前转化化疗患者的5.73个月(χ2=16.775，P<0.001)。行姑息性胃切除术患者的中位生存期为21.57个月，高于未行姑息性胃切除术患者的8.50个月(χ2=18.806，P<0.001)。见图2。

图1 14-3-3 zeta高表达和低表达组的生存曲线

图2 是否行姑息性胃切除术以及术前转化化疗的生存曲线

2.4 影响胃癌伴腹膜转移患者预后的多因素回归分析 以死亡为因变量，以14-3-3 zeta表达水平(低=0，高=1)、行姑息性胃切除术(是=0，否=1)以及术前行转化化疗(是=0，否=1)为协变量，采用Cox回归模型进行多因素分析，结果显示，14-3-3 zeta高表达、未行姑息性胃切除术、术前未行转化化疗均为胃癌伴有腹膜转移患者死亡的危险因素(均P<0.05)，见表2。

表2 影响胃癌伴腹膜转移患者预后的多因素分析

3 讨 论

14-3-3蛋白家族可以和许多信号蛋白结合，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体等，在细胞凋亡、细胞周期以及信号传导的调控等方面发挥重要作用[5]。14-3-3 zeta是14-3-3蛋白家族的重要成员之一，其主要功能是调控凋亡，可通过不同机制对凋亡产生抑制效应，如对B淋巴细胞瘤-2家族的调控[6]。研究表明，14-3-3 zeta在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中均以癌基因的形式存在[7-8]。本研究结果还显示，胃癌伴腹膜转移患者中14-3-3 zeta的表达与肿瘤位置、是否为印戒细胞癌以及腹水的程度可能有关(均P<0.05)，在14-3-3 zeta高表达的胃癌患者中，印戒细胞癌所占比例较多，而在胃癌患者中，印戒细胞癌往往被认为更容易发生腹膜转移并产生腹水，腹水则是胃癌患者出现腹胀症状的主要原因，且此类患者预后极差。

既往研究中，14-3-3家族蛋白已被证实与很多恶性肿瘤的不良预后相关，包括直肠癌、结肠癌、卵巢癌等[9-11]。然而，目前有关14-3-3 zeta在胃癌中表达情况的报道仍较少。腹膜转移是胃癌最为常见也是治疗效果最差的转移方式。至今尚无十分有效的指标用于预测胃癌伴腹膜转移患者的预后。本研究结果显示，14-3-3 zeta高表达组患者中位生存期更短(P<0.05)，提示此类胃癌伴腹膜转移患者的预后较差；进一步多因素分析结果显示，14-3-3 zeta高表达为胃癌伴腹膜转移患者死亡的独立危险因素之一(P<0.05)。因此，14-3-3 zeta蛋白或可作为胃癌伴腹膜转移患者预后的有效预测指标。有研究表明姑息性胃切除术并不能改善胃癌伴腹膜转移患者的预后[12]。而随着化疗药物的发展以及个体化精准治疗的推进，有学者认为姑息性胃切除术可以改善特定的胃癌伴腹膜转移患者的预后[13]，但目前临床上尚无有效的指标用于此类人群的筛查。总之，化疗敏感性好、腹膜转移较为局限的胃癌患者往往可以通过姑息性胃切除术获益。在本研究中，未行姑息性胃切除术、术前未行转化化疗均为胃癌伴腹膜转移患者死亡的独立危险因素(均P<0.05)，而14-3-3 zeta高表达的患者预后更差，因此对于14-3-3 zeta低表达的胃癌患者，可以考虑进行更为积极的术前化疗以及手术干预。

综上所述，胃癌伴腹膜转移患者的肿瘤位置、病理类型及腹水程度可能与14-3-3 zeta表达水平有关；14-3-3 zeta高表达、未行姑息性胃切除术以及术前未行转化化疗的胃癌伴腹膜转移患者预后更差独立危险因素。14-3-3 zeta或可作为胃癌伴腹膜转移患者预后的预测因素，并可为患者的术前化疗及手术干预提供参考。但本研究为回顾性研究，存在较多的混杂因素，此外纳入病例数偏少且均来源自同一医疗中心，因此本研究具有一定的局限性，其结果仍有待于进一步的前瞻性研究证实。