自体源血浆/细胞治疗薄型子宫内膜进展

黄秋艳，杨一华，黄沁玺，刘博，覃爱平

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

薄型子宫内膜是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的厚度阈值，但目前此厚度阈值尚无统一标准，大部分研究认为卵泡中期内膜厚度≤7 mm可称为薄型子宫内膜[1-2]，其在ART中的发生率约为2.4%[1]。近年来的研究认为单纯子宫内膜厚度对ART的妊娠结局并没有预测价值，不建议仅依据子宫内膜厚度来评估子宫内膜容受性、预测ART妊娠结局或取消胚胎移植周期[2]，建议结合内膜的形态类型、血流情况等作综合评价。然而，在内膜厚度≤7 mm时，临床妊娠及活产率显著降低[3]，妊娠期发生产科并发症的风险增加[4]。薄型内膜的病因包括多次宫腔操作史、宫腔炎症及放疗、枸橼酸氯米芬等药物作用以及腺上皮生长不良等，另有部分患者病因不明[1，5]。薄型子宫内膜的厚度不足以让胚胎更靠近供养丰富的螺旋动脉，其产生的活性氧自由基不利于胚胎种植，亦可能与炎症环境异常活化和氧化应激反应异常降低有关[6]。

薄型子宫内膜常规治疗药物包括大剂量雌激素、促性腺激素释放激素激动剂、人绒毛膜促性腺激素、宫腔灌注粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及改善血流灌注的治疗药物如低剂量阿司匹林、维生素E、枸橼酸西地那非[5]。但仍有部分患者常规治疗后子宫内膜仍极薄，根据2018年国内生殖医学相关领域专家编写的“辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识”，对于反复薄型子宫内膜的患者建议选择联合治疗方案，富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)、骨髓或者经血来源的干细胞成为推荐的治疗方案之一[2]。作为薄型内膜前沿的治疗方向之一，近年来PRP及干细胞治疗等研究增多，相对于异体源的血浆/细胞，自体来源具有低免疫原性、低排斥反应、伦理争议少及制备简便等优点。本文对自体源的血浆/细胞在薄型子宫内膜治疗中的应用进行综述分析。

一、自体PRP

PRP由新鲜全血提取，血小板含量是普通血浆的3～5倍，其富含高浓度的生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、某些蛋白质和肽(如纤维蛋白原、纤连蛋白、骨粘连蛋白、骨钙素、血小板反应蛋白)以及某些趋化因子和细胞因子等[7-8]。PRP现多应用于骨骼、肌腱、创面、瘢痕、皮肤等组织再生修复[7-10]。自体PRP中高浓度的生长因子和细胞因子可刺激子宫内膜细胞或子宫内膜干细胞的有丝分裂和增殖，进而激活内分泌旁分泌通路，改善子宫内膜反应，促进胚胎着床和妊娠[11]。PRP亦可减少子宫内膜损伤所致纤维化，增加宫腔局部的抗炎效果，提高子宫内膜容受性[12]。另外，体外试验证实活化的PRP促进子宫内膜上皮细胞、子宫内膜基质成纤维细胞、子宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)和骨髓源性MSC的迁移，促进子宫基质及EnMSCs的增殖[13-14]。

我国中山大学附属第六医院梁晓燕教授团队于2015年首次报道了应用自体PRP宫腔灌注治疗5例薄型子宫内膜患者，治疗后所有患者子宫内膜厚度增加并经IVF-ET成功妊娠[15]。之后她们团队又两次报道了冻融胚胎移植(FET)周期中薄型子宫内膜患者应用PRP治疗的效果，结果发现，治疗组子宫内膜厚度、生化妊娠率、临床妊娠率及胚胎种植率均高于对照组[11，16]。与国外学者Eftekhar等[17]、Zadehmodarres等[18]的研究结果类似。2018年Aghajanova等[19]报道2例严重宫腔粘连所致薄型子宫内膜的患者(34岁和40岁)经宫腔灌注自体PRP后自发妊娠或在IVF-ET帮助下获得妊娠。

二、自体骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMCs)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)

1. BMMCs：作为体内重要的干细胞龛，骨髓液含有多种祖细胞，梯度密度分离法处理后的获取的BMMCs含有造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)等各种成体干细胞。这些细胞多可以合成释放多种促进EPCs迁移、分化和血管新生的因子如VEGF[20]，可用于组织器官再生及修复、促进血管新生、改善局部微环境等[21]。血管发生是以HSCs为中心，边缘为EPCs的血岛形成，经过多重血岛互相融合形成血管网状结构。骨髓源细胞可定植入血管，作为支持细胞促进侧枝循环血管的发生，改善缺血组织的血液循环及缓解缺血状态[22-23]。骨髓移植的患者子宫内膜活检样本中检测到供体来源的子宫内膜细胞，推测骨髓源干细胞在细胞更新和炎症刺激下参与子宫内膜再生[24]。2014年Singh等[25]报道6例Asherman’s综合征患者，经阴道超声引导下于子宫内膜下注射自体BMMCs，5例患者术后3个月恢复月经来潮，内膜由术前的1～2 mm增厚至3.7～6.7 mm不等。2017年Zhao等[26]将附着有高浓度自体BMMCs的胶原蛋白材料移植入5例重度宫腔粘连患者宫腔中，治疗后子宫内膜明显增厚，行IVF-ET助孕均获得妊娠并活产；机制分析显示BMMCs通过降调ΔNp63的表达促进内膜的修复，胶原蛋白支架在术后8周降解。

2. BM-MSCs：MSCs具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌，以及向损伤组织部位迁移并定植即“归巢”等特点，因有特殊的分子表型表达，可通过特定标志物分离筛选[27]。近年来，多类MSCs已经证实对薄型子宫内膜及宫腔粘连治疗有效果[28]。BM-MSCs来源于骨髓，作为最早发现的MSCs，目前在再生医学各领域研究应用较多[29]。有研究报道，人源CD133+BM-MSCs可迁移至受损伤的子宫内膜血管周围，通过旁分泌血小板反应蛋白1和胰岛素样生长因子1(IGF1)等旁分泌分子诱导内膜周围细胞增殖[30]，宫腔移植BM-MSCs后细胞角蛋白和波形蛋白(子宫内膜细胞的标记蛋白)表达较高，同时调节子宫内膜活动的重要因子整合素ανβ3和白血病抑制因子(LIF)表达升高，提高抗炎作用，促进子宫内膜增厚[31]。2011年Nagori等[32]首次报道在1例宫腔粘连所致薄型子宫内膜患者的治疗中，通过免疫磁珠法自骨髓液分离筛选CD9+、CD90+和 CD133+的自体BM-MSCs，于月经第2天经宫腔灌注移植，治疗后月经量增多，术后6个月内膜由治疗前的3.6 mm增厚至7.1 mm，之后IVF-ET助孕成功。

三、自体外周血间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells，PB-MSCs)

MSCs可来源于多类组织，可通过G-CSF从骨髓动员至外周血来源，为PB-MSCs。PB-MSCs和BM-MSCs有相似特性[33]。研究者发现经G-CSF动员后由外周血采集单个核细胞，分选出CD133+PB-MSCs灌注入子宫螺旋动脉，可显著改善严重Asherman综合征和宫腔粘连患者的内膜厚度及妊娠结局：16例治疗患者中有3例术后自发怀孕，7例患者IVF-ET后怀孕[34]。经动员后外周血采集干细胞数量有限，明显低于骨髓来源[33]，该研究分选出CD133+PB-MSCs，相对提高了MSCs的纯度，故效果显著。

四、自体子宫内膜干细胞(endometrial stem cell，EMSCs)/月经血来源间充质干细胞(menstrual blood-derived stromal cells，menSCs)

EMSCs可从经血和子宫内膜活检中获得[35-36]，menSCs具有BM-MSCs类似MSCs表型和多分化潜能，低氧条件下仍具有较强的旁分泌功能和较优的细胞迁移及增殖能力，同时具有抗炎、抗纤维化，免疫调节等优势[37]。经血源干细胞在体外细胞因子及雌激素共培养条件下可向子宫内膜细胞分化，Zhang等[38]研究发现menSCs可促进子宫内膜损伤小鼠的子宫内膜血管生成，厚度增加，提高小鼠的生育力。2016年Tan等[39]报道收集月经第2天经血，经体外培养扩增提纯menSCs，于月经第16天B超引导下宫底注射，治疗7例宫腔粘连Ⅲ-Ⅳ度的患者，其中5例患者子宫内膜厚度增加≥7 mm，3例患者治疗后妊娠(自然受孕1例，胚胎移植受孕2例，妊娠率43%)。上述研究表明经血源干细胞可作为治疗重度宫腔粘连干细胞来源，Phermthai等[40]首次成功从不育妇女身上分离提取自生和无外源EMSCs株系(autogenic and xeno-free EMSC lines)，为临床应用自体子宫内膜干细胞提供了可能。

五、小结及展望

各类自体血浆/细胞治疗在薄型子宫内膜的临床治疗中取得了一定效果，自体源PRP及骨髓、外周血单核细胞的采集制备和通过磁珠筛选MSCs除保证自体来源外，均无需体外扩增培养，避免了细胞培养中的生物污染，临床应用前景良好。但是，对于需体外扩增的menSCs，如何降低生物污染的几率？在保证自体移植下，成体干细胞数量少，如何提高细胞的存活力及移植后增殖力？由于子宫特殊的解剖结构，如何使血浆/细胞持续良好地发挥作用？能否通过优化移植方式提高治疗的效果？

针对上述问题，有几点值得思考：(1)自体MSCs的体外扩增：因自体MSCs的常规体外扩增需要添加胎牛血清之类的生物制品，增加了非人类病原体和病毒传播的风险，亦可引起局部炎症反应，导致移植细胞移植时排斥反应增加[41]。人脐带血源血清富含高效的细胞因子和生长因子，在临床应用中可有助于高质量及低风险的自体MSCs产生[42]。(2)自体MSCs移植后效率：PRP可促进MSCs分化、血管生成、抗炎、组织重建等[43]，PRP促进menSCs的增殖，抑制细胞的凋亡，提高menSCs细胞干性及多能性，联合自体PRP可提高MSCs并且改善子宫内膜容受性及相关蛋白的表达[44]。另外，有研究报道经过转染VEGF基因的BM-MSCs移植治疗薄型子宫内膜提高了子宫内膜容受性，可能比单纯干细胞治疗效果更好[45]。(3)治疗方式：宫腔灌注及内膜下注射可直接提高局部组织的干细胞浓度，保证植入部位的准确，但是由于子宫腔的特殊解剖结构，液状的血浆及细胞悬液无法长期粘附在子宫肌层及内膜表面，联合应用可降解生物支架材料等进行细胞宫腔内移植，延长细胞与创面的接触时间，可提高修复作用[26]。另外，有报道称全身给药比局部注射能更好地使骨髓源干细胞归巢至子宫内膜[46]，但是仍需将全身用药可能发生的炎症反应等考虑在内，同时需要更多的研究支持。(4)治疗时间：生理状态下子宫内膜在月经期脱落后，在雌激素的作用下进行增殖修复，月经期移植自体源细胞[34]取得较好的临床效果，宫腔创面局部处理及搔刮亦可取得类似效果[26]。

自体源PRP及单核细胞、间充质细胞在目前薄型子宫内膜的临床研究中取得一定效果，充分发挥了自体来源这一得天独厚的优势，结合各类血浆/细胞的优缺点，选择更高效、更优化组合等治疗方式，可最大程度提高治疗的效果。