细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

邹梦蝶，鲁妍兵，李婉明

(中国医科大学生命科学学院卫生部细胞生物学重点实验室医学细胞生物学教育部重点实验室细胞生物学教研室，中国辽宁沈阳110122)

核酸适配体(aptamer)通常是指在体外利用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的一段短的寡核苷酸片段(ssDNA或RNA)，它能与靶标高亲和力、高特异性的结合[1～2]。核酸适配体通过分子内碱基配对形成如假结(pseudoknot)、发夹(hairpin)、凸环(coronal ring)、G-四链体(G-quartet)等稳定的二级结构，从而使其具有特定的分子构象[3]。作为一种“化学抗体”，核酸适配体与靶标的结合类似于抗原-抗体的结合方式，而且与蛋白质抗体相比，核酸适配体有着更大的靶标范围，包括多肽[4]、金属离子[5]等小分子物质，以及生长因子[6]、酶[7]等生物大分子，甚至完整的细菌[8]和活细胞[9]等。

目前很多核酸适配体的获得都是针对特定的靶标筛选而来的，其中以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)的靶标物质通常是整个活细胞[10]。现阶段cell-SELEX筛选主要存在以下两种思路[11]。其一，靶细胞直接为过表达某种靶蛋白的细胞系，消减细胞为不表达该靶蛋白的细胞系，比如Kim等[12]利用过表达上皮黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的肝癌细胞HepG2进行筛选，消减细胞为HepG2细胞，筛选出针对EpCAM的核酸适配体。其二，直接对某一肿瘤细胞系进行筛选，消减细胞为正常细胞系或相关肿瘤细胞系，然后再用得到的核酸适配体来“钓取”及鉴定靶标[13]。这种策略在筛选开始前不用对细胞表面的分子及结构等信息进行准确的了解，而且获得的核酸适配体可直接用于活细胞的识别，这使得核酸适配体在细胞分子的识别、疾病相关生物标志物的发现，以及疾病的早期诊断和靶向治疗等方面显示出强大的实际价值和应用前景[14～15]。本文针对目前在cell-SELEX基础上发展起来的新策略进行总结。

1 以全细胞为靶标的筛选(cell-SELEX)

1998年，Morris等[16]首次成功针对复杂靶标进行了细胞核酸适配体的筛选，为全活细胞SELEX筛选的发展开辟了道路。这种以全细胞为靶标的筛选将整个活细胞作为靶标物质，区别于从细胞中分离纯化出蛋白质组分，利用完整的细胞表面分子与单链核酸之间的相互作用来进行分子识别[17]。

通常情况下，无论是采用已知靶标或者是未知靶标的筛选方式，在筛选的过程中都会引入一个消减的策略，使得筛选到的核酸适配体具有更强的结合特异性，同时为了有效减弱甚至消除既与靶分子结合又与靶分子类似物结合的核酸序列，通常在每轮正向筛选后增加一个反向筛选，从而可以更可靠地筛选出与靶分子具有高度结合特异性的核酸适配体[18]。也就是说，cell-SELEX用来筛选特异性识别靶细胞的核酸适配体的核心技术是依靠任意两种完整活细胞表面分子水平上的差异来完成的。理论上，只要两种细胞之间存在分子水平上的差异，就能够通过消减cell-SELEX技术筛选出特异性识别这种分子水平差异的核酸适配体[19]。这种筛选方法具有很多特有的优点[20]:1)核酸适配体能够识别具有天然构象的分子，具有更大的实际应用价值;2)一次筛选可获得多个识别不同靶标的核酸适配体;3)核酸适配体不仅可用于发现新的生物标志物，还可为相关疾病的早期诊断和靶向治疗提供有效的分子工具。

目前，利用这种消减策略已经筛选出多个靶向不同类型肿瘤细胞[21～25]的核酸适配体，当然也有一些是靶向感染细胞[26]或正常细胞[27]的核酸适配体，这对核酸适配体在初期临床诊断和治疗等生物医学领域的研究与应用十分有利。本课题组利用消减cell-SELEX技术，以转移性大肠癌细胞系LoVo为靶细胞，非转移性细胞系HCT-8为消减细胞，成功获得了一组靶向转移性大肠癌细胞的核酸适配体[22]，这些核酸适配体有望在早期转移性大肠癌的诊断和治疗中发挥作用。针对感染细胞的核酸适配体可用于诊断一些具有潜伏期的传染性疾病，例如:Graham等[26]利用感染/未感染人乳头瘤病毒的HeLa细胞作为配对细胞进行SELEX筛选，成功筛选出不能与感染此类病毒的宫颈癌细胞结合的核酸适配体，可用于宫颈癌的初期诊断，同时也可用于鉴定癌细胞有无乳头瘤病毒感染。Kim等[27]利用3T3-L1的成熟脂肪细胞和前脂肪细胞作为配对细胞进行筛选，获得了针对成熟白色脂肪细胞的核酸适配体，将此核酸适配体与药物分子相连，则有望进行抗肥胖治疗相关的研究。这些通过消减cell-SELEX技术筛选获得的核酸适配体，不仅可直接用于整个细胞的识别，还可以对与其结合的靶标进行纯化、鉴定，这样新的分子标志物就有可能被发现。

2 细胞特异性核酸适配体在肿瘤研究中的应用

由于核酸适配体具有独特的高亲和性、高特异性、高稳定性和易于修饰等优势，因此其在进行疾病的早期诊断和靶向治疗中具有重要的临床意义，尤其是肿瘤研究领域，利用cell-SELEX筛选获得的核酸适配体具有其独特的优势。Shangguan等[28]利用消减cell-SELEX技术获得一组白血病细胞特异性的核酸适配体，初步鉴定它们的靶分子有些是膜表面的蛋白质，也有些是其他细胞表面分子，如脂类或糖类物质等。根据靶标的不同特性，利用cell-SELEX获得的核酸适配体可以进行不同的功能性应用。1)利用核酸适配体结合细胞表面分子的能力，可以将其与荧光基团、放射性同位素或纳米材料等结合，从而用于特异性细胞的富集和成像[29]。比如:将荧光基团Cy5标记针对B细胞淋巴瘤的核酸适配体TD05后，可将其用于针对裸鼠肿瘤的高特异性体内靶向成像[30];2)利用核酸适配体结合细胞表面受体的能力，可以将其用作载体，实现将多种物质靶向递送至特定的细胞/组织[31]。我们课题组前期利用大肠癌特异性核酸适配体L33作为载体，构建了抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin，DOX)的靶向递送系统(L33-DOX)[32]。L33-DOX选择性地被摄入靶细胞中并实现靶向杀伤作用，同时还可降低对非靶细胞的毒性作用;3)利用核酸适配体结合信号转导关键分子的能力，可以将其作为阻断特定信号传导途径的特异性治疗剂[33]。由于利用cell-SELEX筛选获得的核酸适配体是基于它们与靶细胞的结合而被筛选出来的，其中一组筛选获得的核酸适配体并不都结合于同一个靶分子但结合于同一靶细胞，因此这些核酸适配体可以联合应用进行多靶点的诊断和治疗应用[34]。这是cell-SELEX技术与以单一物质作为靶标的经典SELEX方法相比所具有的独特优势。

3 Cell-SELEX筛选的新策略

传统的cell-SELEX筛选仍然存在一些不足，比如筛选效率低、周期长、获得的核酸适配体性能不佳等问题。此外，细胞表面分子相对单一靶分子来说较复杂，以全细胞为靶标进行筛选具有更大的难度。因此，不少研究者针对这些问题发展和建立了新的更为高效的细胞核酸适配体筛选方法和技术。

3.1 荧光激活细胞分选SELEX(FACS-SELEX)

Mayer等[35]将流式细胞仪结合到细胞核酸适配体的筛选中，利用流式细胞仪的分选功能，建立了一种基于流式细胞仪的荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting-SELEX，FACSSELEX)，以用于细胞核酸适配体的筛选。该方法将荧光标记的寡核苷酸文库与靶细胞一起孵育，这样流式细胞仪可以高灵敏、高通量、高效地同时区分和分离与序列结合的细胞，然后将结合的序列进行洗脱、纯化和扩增。细胞膜的完整性是cell-SELEX筛选成功的先决条件，因此在筛选的过程中必须消除由死细胞造成的非特异性吸附所带来的核酸序列，而流式细胞仪可以通过在膜完整细胞的正向和侧向散点图中设置感兴趣区域来排除死细胞的影响，从而可以有效地消除假阳性，提高筛选效率。Mayer等的实验仅用10轮筛选便成功得到了特异性核酸适配体。2014年，Kim等[12]采用此方法，仅经过7轮的筛选就获得了针对上皮细胞黏附分子(EpCAM)的核酸适配体，EpCAM是一个在大多数腺癌和肿瘤干细胞中表达的跨膜蛋白，利用该抗EpCAM的核酸适配体可以开展干细胞标记物或干细胞或肿瘤细胞相关的其他研究。

3.2 单壁碳纳米管辅助细胞SELEX(SWCNTs辅助cell-SELEX)

单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)因其独特的电化学和机械性能以及广阔的应用前景而不断地被探索[36]。单壁碳纳米管辅助细胞SELEX技术是一种以单碳纳米管为辅助的细胞筛选方法，与传统的cell-SELEX方法相比，单壁碳纳米管辅助细胞SELEX技术具有更高的筛选效率，能够有效地缩短筛选的周期[37]。在细胞筛选过程中将特异性和非特异性结合的单链序列分开是提高筛选效率的重要步骤之一，传统的cell-SELEX方法主要使用简单洗脱的方法来实现，但往往会导致分离的不完全，甚至造成筛选效率的低下;而SWCNTs辅助cell-SELEX方法利用核酸能够通过π-π堆积力而成螺旋形地包裹在单壁碳纳米管上的原理[38]，使与靶标特异性结合的核酸序列仍然结合在细胞表面，而不能与靶标特异性结合或者结合力比较弱的核酸序列则被吸附在纳米管上，从而实现非特异性和特异性序列的快速、有效、准确的分离。2014年，Tan等[39]首次报道了这种方法，其以鼻咽癌细胞作为模型进行筛选，只进行了6轮的筛选就成功地获得特异性识别靶细胞CNE2的核酸适配体，这与常规cell-SELEX的15轮筛选周期相比，大大缩短了细胞筛选周期，为cell-SELEX的筛选提供了一个新的视角，也引起了生物医学领域研究者的高度关注。相信在未来的发展中，SWCNTs将在核酸适配体的筛选及应用中发挥更大的使用潜能。

3.3 基于芯片的细胞SELEX(on-chip cell-SELEX)

微流控芯片技术具有功能可集成化、操作简便、高通量等一系列的优点，在生物医学领域也展示出广泛的应用价值。Hung等[40]在传统cell-SELEX方法的基础上，整合微流控芯片技术，建立了一种速度快、通量高、效率高的自动化筛选方法——基于芯片的细胞筛选技术(on-chip cell-SELEX)。该方法的核心是先将上皮细胞抗体修饰在磁珠表面，并将其先与靶细胞孵育，再与核酸文库进行孵育，抗体与靶细胞结合使磁珠包被在细胞表面，形成的磁珠靶细胞适配体结合物可以在通过外磁场作用分离出来的同时进行PCR扩增。该方法以卵巢癌细胞TOV21G为靶标，只进行了5轮的筛选就成功获得了13种卵巢癌细胞高特异性结合的核酸适配体。此外，每轮筛选时间大大缩短，由9 h降到3 h，筛选效率大幅度提高。2015年，Hung等[41]利用此自动化系统进一步成功筛选出多个特异性结合直肠癌细胞(CRSC/CRC)的核酸适配体，其中3个核酸适配体与靶细胞具有很强的亲和力，解离常数分别达到27.4 nmol/L、28.5 nmol/L和12.3 nmol/L。基于芯片的细胞筛选技术不仅能够克服人为操作导致的不利因素，提高筛选效率，而且在微流控通道中可以运行单个细胞，对后续的收集及PCR扩增十分有利[42]。然而，目前该方法的应用仍旧很少，发展仍旧很慢，主要原因是芯片的设计和制作不仅成本较高，而且还有较高的专业性要求。总的来讲，如果微流控芯片可以实现产业化生产，其必定能在未来成为筛选核酸适配体的主流技术。

3.4 体内细胞SELEX(in vivo cell-SELEX)

随着cell-SELEX技术的改良与发展，研究者发现利用体外细胞系作为靶细胞进行筛选得到的核酸适配体，虽然在一定程度上能够模拟体内活细胞，但由于核酸适配体的构象会受到其所处环境的影响，因此体外筛选所得的核酸适配体在体内应用时往往受到限制。2010年，Mi等[43]报道了一种新的体内筛选方法(in vivo cell-SELEX)，即通过静脉注射的方式将2′-氟嘧啶修饰的随机RNA文库注入肝内结直肠癌转移小鼠模型体内，一段时间后处死小鼠取出瘤体，分离并反转录与瘤体结合的RNA分子;14轮体内筛选后，成功获得了RNA解旋酶的核酸适配体。2013年，Cheng等[44]同样利用体内筛选的方法，获得了能够通过血脑屏障与脑毛细管内皮细胞和实质细胞结合的核酸适配体，这为药物的脑靶向输送提供了可能。在正常生理条件下，筛选获得的核酸适配体能够直接在体内识别原位的潜在靶细胞，从而鉴别不同组织或抑制体内靶细胞中特定的靶分子，这是体内筛选的最大优势。理论上，体内筛选更符合实际医学领域的应用，具有更广阔的前景[45～46]。

4 结语与展望

SELEX技术自建立至今已有近30年的发展历程，虽然筛选方式不断得到改进，甚至出现了自动化的筛选方式，但是目前为止，尚未建立起一个标准化的筛选流程。SELEX筛选仍是现阶段制约核酸适配体应用发展的关键，以全细胞为靶标的cell-SELEX技术为例，细胞表面分子的复杂性加剧了筛选的困难程度，并不是每次的筛选都能保证得到理想的核酸适配体。因此，开发更为高效且实用的cell-SELEX核酸适配体筛选方法是非常有必要的，这仍需广大研究者的深入探索。相信在不久的未来，核酸适配体的筛选及应用必将展示更大的潜能。