芦可替尼在骨髓增殖性肿瘤治疗中的应用及对免疫细胞的作用研究进展

葸 瑞 综述，白 海 审校

(中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院血液科,兰州 730050)

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一种危及生命的血液病性恶性肿瘤，其主要是由JAK信号转导因子和转录激活因子(STAT)信号网络调控失调，炎症状态加重导致的，主要分为原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)、真红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)3种[1]。其临床表现主要有脾肝肿大、血细胞异常、髓外造血、贫血、腹胀和早饱等症状[2-3]。MPN的传统治疗方法(羟基脲、干扰素、脾切除、脾区照射)在临床上也获得了一定的疗效，但是由于传统方法的收益有限或者容易引起较多的不良反应，治疗具有一定的局限性[4]。目前，异基因造血干细胞移植仍是治愈MPN的唯一方法，但是移植标准只有极少数的患者可以达到，而且移植相关病死率也较高[5]。相较于传统治疗方法，新型靶向药物因具有治疗效果优、治疗时间短、对人体正常组织细胞基本无毒副作用及不良反应等特点，在MPN的治疗中得以应用推广[6]。MPN靶向药物磷酸芦可替尼(Ruxolitinib)可通过阻断JAK/STAT信号通路对MPN患者的细胞因子活化作用，从而达到治疗MPN的目的。

1 MPN的发病机制及芦可替尼的作用机制

MPN患者中有超过一半的是由于JAK2V617F的突变引发的疾病，JAK2是定位于9号染色体短臂2区4带(9p24)的胞内酪氨酸蛋白激酶(PTK)，与JAK1、JAK3和酪氨酸激酶-2(Tyk2)同属于JAK家族的非受体蛋白酪氨酸激酶[7]。JAK2由多种细胞因子激活，包括促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、生长激素、催乳素和IL-3，并与其他受体一起参与IL-6、粒细胞集落刺激因子(GCSF)和IFN-γ的信号转导[8]。JAK2在人体造血祖细胞分化、增殖相关信号传导的过程中起关键作用[9]。JAK2V617F突变是一种获得性突变，主要是因位于假激酶结构域( JAK homology domain，JH) 617 位密码子(GTC)第一位碱基发生G-T的替换，从而使苯丙氨酸替代了编码的缬氨酸，导致JAK2表达被激活，从而使JAK-STAT信号通路激活，使造血祖细胞在缺乏促造血因子的情况下仍能持续增殖，最终导致疾病的发生[7，10]。芦可替尼是一种JAK1、JAK2的选择性抑制剂，可抑制JAK1/2激酶结构域，催化亚基上的ATP结合位点来实现对JAK活性的抑制作用，可以从发病机制上达到治疗疾病效果；另外，芦可替尼还可抑制炎症因子的JAK1信号传导，减轻患者相关临床症状，且芦可替尼对于野生型及突变型JAK2均有抑制作用[7]。

2 芦可替尼在MPN患者中的应用现状

芦可替尼是一种选择性的JAK抑制剂，早在2011年美国食品药品监督管理局(FDA)已批准使用JAK2抑制剂芦可替尼治疗中高危骨髓纤维化患者，2014年12月批准羟基脲不耐受或耐药的真性红细胞增多症患者也可用芦可替尼进行治疗。2012年12月欧盟药品局(EMA)批准可用芦可替尼治疗包括PMF、PV后骨髓纤维化和ET后骨髓纤维化的中危或高危骨髓纤维化。2017年3月10日中国国家食品药品监督管理局批准芦可替尼治疗中高危PMF、PV继发的骨髓纤维化或者ET继发的骨髓纤维化的成年患者[11-12]。

目前，已有大量的评价芦可替尼治疗效果和安全性的临床试验正在进行中。2013年欧洲白血病网(ELN)通过comfort-Ⅰ、comfort-Ⅱ两项临床试验评价芦可替尼在PMF患者中疗效和安全性，comfort-Ⅰ是一项随机的临床Ⅲ期试验，其结果显示芦可替尼可以明显地缩小骨髓纤维化患者的脾脏体积、改善其全身症状，治疗效果显著；comfort-Ⅱ试验将当前最有效疗法与芦可替尼治疗PMF的临床疗效进行对比，发现服用芦可替尼后，PMF患者的脾肿大症状显著改善，疾病的其他相关症状也得到了缓解，可以显著且持久的提高患者生存质量[13-14]。VANNUCCHI等[15]通过response试验评价芦可替尼治疗PV患者的疗效和安全性，结果显示芦可替尼在控制血细胞比容、缩小脾脏体积、降低JAK2 V617F等位基因负荷等方面明显优于标准治疗方法。在后期长达80周的随访中发现，芦可替尼对于羟基脲耐药或不耐受PV患者也有较好的疗效和安全性[16]。HARRISON等[17]通过majic试验评价芦可替尼对羟基脲耐药或不耐受 ET 患者中的疗效，结果显示芦可替尼在治疗ET瘙痒、肌肉酸痛、盗汗等相关全身症状时疗效优于当前最有效疗法。封媛媛[18]观察了芦可替尼治疗PMF患者的疗效及其不良反应发现，患者的脾脏缩小较明显，同时骨髓纤维化的其他症状也得到了明显的改善，但是患者出现了贫血和血小板减少的不良反应。

3 芦可替尼对MPN患者细胞生物学的影响

3.1树突状细胞(DC) DC是1973年由加拿大学者Steinman发现的，DC主要分布在皮肤和鼻腔、肺、胃与肠的内层，血液中也可发现其未成熟型。DC的总数量不及外周血单核细胞的1%，但它是功能强大的专职抗原递呈细胞(APC)，DC自身具有免疫刺激能力，可调节适应性免疫反应[19]。肿瘤的发生、发展与DC之间有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好，有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。

芦可替尼对MPN患者的DC是否有影响，国内外研究学者做了相关研究。HEINE等[20]探讨芦可替尼是否影响DC生物学，在整个DC细胞分离分化过程中，低剂量的芦可替尼对DC细胞的凋亡无明显的诱导作用，当药物以更高的浓度或反复使用时，可以观察到大量的细胞死亡，高剂量的芦可替尼几乎完全阻断了单核细胞源性DC的体外发育。在刺激Toll样受体(TLR)后，脂多糖诱导的CD83细胞分泌的白细胞介素-12(IL-12)明显减少，人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)信号作为推动DC分化的关键因素，芦可替尼对GM-CSF和IL-4细胞因子信号有明显的抑制作用。研究还发现芦可替尼可降低DC在体内外的迁移能力，延缓腺病毒感染小鼠的腺病毒清除率，接受芦可替尼治疗的小鼠体内保留了更高的病毒载量。RUDOLPH等[21]通过离体耳真皮内建立的体外爬行实验分析了芦可替尼对DC迁移的影响。研究结果发现，芦可替尼明显的抑制了DC的体外迁移，芦可替尼诱导的DC的迁移调控与JAK无关，主要是通过非靶向抑制介导实现的。

3.2T淋巴细胞 在过去的几年中有学者关于JAK抑制剂对免疫系统的T细胞和其他关键组分的影响进行了研究，同时就芦可替尼对MPN患者T细胞方面的影响也做了相关研究。MASSA等[22]对18例仅接受芦可替尼治疗的骨髓纤维化患者进行了评估，结果显示，与健康对照组相比，接受了芦可替尼治疗的患者CD25+调节性T细胞(Tregs)显著降低，在90 d及长达570 d的治疗中骨髓纤维化患者的Treg值始终低于健康受试者的下限，研究发现芦可替尼停药或者减量都会影响Tregs的数量，其对Tregs的影响是一个不可逆的过程。PARAMPALLI等[23]发现在治疗过程中，芦可替尼可以使MPN患者的CD3总数、辅助T细胞群数量迅速减少，同时患者的TBET1、RORγt和FOXP3 mRNA和蛋白表达水平有所下降，但蛋白表达水平与对照组相比无明显变化(P>0.05)。体外实验结果发现，芦可替尼在体外可以抑制T细胞增殖，并分别抑制Th1、Th2和Treg的分化。PERNER等[24]对JAK抑制剂是否影响T细胞进行了初步研究，体外实验结果显示芦可替尼可显著降低T细胞活化的标记物，并抑制T细胞的增殖，同时还可以削弱T细胞的异源反应活性。KEOHANE等[25]研究JAK抑制剂对50例MPN患者外周血CD4 T细胞亚群的频率和功能的影响，结果发现MPN患者CD4 T细胞亚群的数量比健康对照组降低，服用JAK抑制剂治疗后更明显，MPN患者治疗6个月后体内T辅助细胞-17(Th-17)数量增加。体外细胞试验也显示，芦可替尼可以诱导T辅助细胞百分率增加，从而导致细胞因子中CD4 T细胞群体比例显著增加。

3.3自然杀伤 (NK)细胞 NK细胞是一种先天免疫效应细胞群，具有识别靶细胞、释放杀伤介质(穿孔素、NK细胞毒因子和肿瘤坏死因子)、分泌细胞因子等功能，在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生、发展过程，NK细胞功能必须通过各种活化和抑制性NK细胞受体之间的复杂平衡状态来严格调控，通过JAK/STAT途径介导的细胞因子信号是NK细胞活化的关键因素[26]。SCHÖNBERG等[27]观察了芦可替尼对人体中NK细胞增殖、活化、杀伤、降低细胞毒性能力的影响。相对于细胞因子介导的激活，NK刺激通过NK特异性受体NKP46起作用并不受芦可替尼的影响。芦可替尼治疗后NK细胞成熟功能受损，未成熟NK细胞比例增加，这些影响可能会减弱机体的抗感染防御，增加感染并发症的风险，如果患者曾接受过如干扰素-α等药物治疗的话，就必须考虑潜在的危险，防止克隆性疾病的出现。CURRAN等[28]从健康供体白细胞浓缩物或MPN患者血液样本中分离得到NK细胞，通过体外细胞试验得到，芦可替尼对体内NK细胞功能有损害，可以显著的降低MPN的患者中循环NK细胞数量，同时发现单核细胞源DC(MODC)刺激的NK细胞不受芦可替尼的影响。研究结果显示芦可替尼在治疗MPN的患者时对体内NK细胞数量和功能产生抑制，同时还可以减弱T细胞的作用。

MPN的发病机制与JAK-STAT信号通路密切相关，患者表现为炎症状态，包括炎症因子[IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和促血管生成细胞因子(血管内皮生长因子和血小板源性生长因子)的明显升高，JAK抑制剂芦可替尼可以改善MPN患者的炎性反应，能够显著并持续性缩小骨髓纤维化患者脾脏的体积，改善疾病相关的体质性症状，从而提高生活质量，并有良好的耐受性，其治疗MPN主要是通过阻断异常的 JAK-STAT 信号通路来实现的。血液系统疾病中还有多种疾病及状态与上述T、B、NK细胞功能异常有关，致体内细胞因子水平异常，而出现病理状况的疾患，例如噬血细胞综合征就是各种原因导致T/NK细胞持续活化，巨噬细胞分泌大量细胞因子，产生细胞因子风暴，导致细胞免疫缺陷、全身高炎性反应，移植后GVHD也是因供受者组织相容性抗原不同，植入T细胞活化，引起IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子释放，同时也有供者B细胞的致敏、活化，综合因素导致受累器官、组织的损害[29-31]，对于JAK-STAT通路激活细胞及细胞因子的释放有关的上述疾患，JAK-STAT抑制剂临床已有应用，也有报道取得良好效果，尤其是一线药物治疗效果欠佳的难治性GVHD的治疗，所以对这类疾病今后可进一步深入探索应用。