一株苏云金亚种的发酵产物对柳蚜3种保护酶活性的影响

唐箫濛，毛洪波

(1.东北林业大学林学院，哈尔滨150040；2.阿城区林业局，哈尔滨150300)

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)简称Bt，1901年由日本生物学家S. Ishiwata在家蚕中首次发现, 1915年德国Berliner从地中海粉螟幼虫体内分离并命名，1953年Hannay确定蛋白晶体为该菌的主要主要杀虫成分[1-2]。苏云金杆菌是一类产生晶体、具有杀虫活性的芽孢杆菌[2]，因无污染、对人畜相对安全等特点成为目前研究和应用最为广泛的微生物杀虫剂[3-4]。据报道，苏云金芽孢杆菌主要对鳞翅目、双翅目、鞘翅目幼虫具有杀虫活性，生产实践中也常用于防治上述农林害虫[5-6]。苏云金杆菌制剂是依靠被昆虫取食后δ-内毒素在消化系统中与中肠细胞受体结合导致细胞膨胀解体，同时在这一过程中破坏了细胞间跨膜电势与酸碱平衡，干扰养分吸收，最终导致昆虫死亡[7]。近年来对于Bt的研究主要集中在其 δ-内毒素方面，包括ICP 基因重组改造、构造工程菌，以提高内毒素的杀虫效率，扩大杀虫谱，延长有效期等[8]。有关细菌对蚜虫的作用研究较少，如粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensKI 3)和阴沟肠细菌(Enterobactercloacae，KI 63)对蚜虫均有明显的杀灭作用[9]；特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)对高粱蚜(Melanaphissacchari)具有57.3%的致死率[10]。但苏云金芽孢杆菌对蚜虫毒杀作用和防御酶活性影响的研究尚未见报道。正常情况下，机体通过体内的保护酶系维持自由基的代谢平衡[11]，当昆虫受到农药胁迫之后，昆虫体内会诱发细胞大量产生各种活性氧物质， 而活性氧会导致体内的细胞膜脂质过氧化、影响细胞内的信号传导和基因表达等多种生理活动[12]。大量研究表明，昆虫体内的保护酶在其适应逆境以及抗药性形成等方面都有直接联系，在昆虫生长发育、杀虫剂渗入和病原微生物侵染等情况下发挥着清除自由基、保护机体免受或减轻伤害的作用[8-13]。本文在测定一株苏云金杆菌亚种对柳蚜(AphisfarinosaGmelin)具有一定生物活性的基础上，研究了苏云金亚种发酵产物对柳蚜过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影响，旨在阐明该株苏云金杆菌对蚜虫的毒力及其作用机制，为利用该菌株研制杀蚜剂和生产防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及虫源

菌株为苏云金亚种(Bt)由本实验室分离获得。柳蚜(AphisfarinosaGmelin)生长于东北林业大学校实验林场旱柳嫩枝枝梢上，用于生物测定。

1.2 试剂盒

考马斯亮蓝试剂盒(可见分光光度法)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)，以上试剂盒均选用上海优选生物科技有限公司生产。

1.3 苏芸金杆菌供试菌液的制备

取0.01g菌粉在无菌环境下用无菌水稀释107倍，取苏云金杆菌菌液 0.1mL涂于灭菌LB固体培养基上活化，恒温28(±1)℃培养24h。然后接种于LB斜面培养基，恒温28(±1)℃培养24h后接种到液体LB培养基中，28(±1)℃、120r/min震荡培养48h作为原液备用[14]。将1mL原液稀释为10-7浓度并取0.1mL涂于固体LB培养基培养恒温(28±1℃)培养24h，重复3次，进行活孢子计数，根据计数结果将原液配制为100亿芽孢/mL的菌液并分为3份备用。一份加无菌水稀释至200、400、800、1600、3200倍液用于柳蚜生物测定；第二份稀释800倍后用于针筒式滤膜过滤器过滤(0.2μm孔径)，去除发酵液中苏芸金杆菌芽孢和伴孢晶体，第三份稀释至800倍液和经过过滤的第二份用于酶活测定。

1.4 生物测定

将稀释为200、400、800、1600、3200倍的菌液按相同剂量分别均匀喷洒于柳蚜危害的样枝上，清水为对照组，72h后分别统计各处理柳蚜死亡和存活数量，并计算死亡率和校正死亡率。

1.5 酶液制备及酶活测定

在室内将患虫病枝去除叶片后水培，取稀释至800倍的苏云金芽孢杆菌菌液过滤与无过滤组按相同剂量均匀喷洒至嫩枝柳蚜上，于6、12、18、24、30h分别取活虫作为样品，样品用液氮处理后保存于-80℃冰箱中备用。

取0.1g柳蚜样品于2mL离心管，与1mL提取液(蒸馏水)混合匀浆，8000g，4℃，离心10min，上清液按上海优选生物科技有限公司生产的考马斯亮蓝试剂盒对选取样本的蛋白含量测定。通过计算出的蛋白含量计算过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶比活力。3种保护酶比活力计算公式如下：

SOD：

抑制百分率=(A对照管-A测定管)÷A对照管×100%

SOD活性(U/mg protein)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr)×样本稀释倍数

注：V反总：反应体系总体系，1.026mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.09mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

CAT：

CAT(U/mg protein)=[△A×V反总÷(Σ×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T

注：V反总：反应体系总体系，1.035×10-3L；Σ：H2O2摩尔消光系数，4.36×104L/mol/cm；V样：加入样本体积，0.035mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，1min。

POD：

POD(U/mg protein)=△A×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T

注：V反总：反应体系总体积，1.07mL；V样；加入样本体积，0.015mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

1.6 数据处理

每组处理3次重复，试验结果以“平均值±标准误(SE)”表示。生物测定数据采用EXCEL和SPSS 17.0软件求出LD50并进行t-检验和单因素方差分析，并用p<0.05 为可接受的显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 苏云金亚种液体发酵产物对柳蚜的毒力测定

表1 苏云金亚种液体发酵产物对柳蚜的毒力测定结果

利用苏云金杆菌苏云金亚种液体发酵产物的不同稀释液喷洒处理柳蚜危害枝条，72h每处理随机统计500头蚜虫，其死亡率及校正死亡率见表 1。200倍液、400倍液和 800倍液校正死亡率均达 50%以上，其中200倍液死亡率、校正死亡率分别为80.40%和78.88%，且3浓度校正死亡率之间差异显著(p<0.05)。而1600 倍液、3200倍液校正死亡率分别为40.09%和29.74%。

2.2 苏云金亚种发酵产物处理与柳蚜3种保护酶比活力的关系

2.2.1 对超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影响

图1 苏云金杆菌对柳蚜超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影响

注：在黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mg protein)，CK 为对照组、A1 为过滤组、A2为无过滤组。

利用苏云金亚种发酵液和发酵液滤液处理柳蚜，清水处理为对照，并在5个时间点取样、测定柳蚜超氧化物歧化酶(SOD)活力。图1结果显示，6h 3处理间柳蚜超氧化物气化酶(SOD)比活力无显著差异(p<0.05)12～30h苏云金亚种发酵液处理组柳蚜SOD的比活力均低于对照,且18h、24h SOD的比活力显著低于对照(p<0.05)，其柳蚜SOD比活力分别比对照低38.11%和26.31%，但30h SOD比活力显著高于对照。苏云金亚种发酵液滤液处理组12～24h柳蚜SOD的比活力均显著低于对照(p<0.05)，其柳蚜SOD比活力比对照低4.69%～36.79%，且呈逐渐升高的趋势，苏云金亚种发酵液和发酵液滤液均能抑制柳蚜SOD的比活力(除滤液处理组30h)，从而影响柳蚜正常的新陈代谢。

2.2.2 对柳蚜过氧化氢酶(CAT)比活力的影响

图2 苏云金杆菌对柳蚜过氧化氢酶(CAT)比活力的影响

注：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位，CK 为对照组、A1 为过滤组、A2为无过滤组。

图2显示，利用苏云金亚种发酵液和发酵液滤液处理后，柳蚜过氧化氢酶(CAT)比活力均呈先升后降的趋势，但发酵液处理组和滤液处理组CAT活力高峰分别出现在12h和18h，其CAT比活力分别比对照高88.89%和194.63%。发酵液处理组12h、18h CAT比活力显著高于对照(p<0.05)，24h显著低于对照(p<0.05)，其比活力仅为对照的52.07%；滤液处理组6h、18h 和30hCAT比活力显著高于对照(p<0.05)，其比活力分别为对照的1.8657倍、2.9463倍和1.6597倍，24h显著低于对照(p<0.05)，其比活力比对照低30.48%。发酵液和滤液处理18h前对 CAT的比活力总体呈激活作用，两者对柳蚜CAT比活力的影响趋势基本相同，但在时间点上有所不同。

2.2.3 对柳蚜氧化物酶(POD)比活力的影响

图3 苏云金杆菌对柳蚜过氧化物酶(POD)比活力的影响

注：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位，CK 为对照组、A1 为过滤组、A2为无过滤组。

苏云金亚种发酵液和滤液对柳蚜氧化物酶比活力(POD)的影响见图3。苏云金亚种滤液处理组柳蚜过氧化物酶(POD)比活力呈先升后降的趋势，而发酵液组柳蚜过氧化物酶(POD)比活力呈升-降-升-降的趋势，滤液和发酵液处理组POD比活力高峰分别出现在12h和18h。滤液处理组对POD比活力总体呈激活作用，其激活率为14.78%～57.39%；而发酵液处理组6h和18h POD比活力显著高于对照(p<0.05)，分别为对照的1.4867倍和1.7982倍，其他时间点POD比活力与对照无显著差异。

3 结论与讨论

蚜虫做为多种主要农林植物的严重主要害虫，其发育周期短、繁殖速率快、生活隐蔽、吸食植物汁液，常常造成严重的经济损失严重[15-16]。对该类害虫的防治多以化学防治为主，不仅造成环境污染和残留、还易再度猖獗[17-18]。本研究以苏云金杆菌苏云金亚种发酵产物为材料，5种浓度的稀释液对柳蚜的致死率达29.74%～78.88%，其200倍液处理柳蚜校正死亡率与粘质沙雷氏菌(KI 3)和阴沟肠细菌(KI 63)对油菜(Brassicasp．)蚜虫防治效果相近[9]，显著高于特基拉芽孢杆菌(RA1402)对高粱蚜虫的致死率(57.3%)，是一株对柳蚜具有较高毒力的生防微生物。苏芸金杆菌类发酵简单、成本低廉、杀虫谱广、环境友好，是目前广泛应用的微生物杀虫剂。该苏云金亚种对柳蚜显示一定的生物活性，是一株具有研究价值和应用前景的生防细菌，但杀蚜组分及其致病机制有待进一步研究。

昆虫体内的超氧化物歧化酶( SOD)、过氧化氢酶( CAT)和过氧化物酶( POD)等保护酶在对体内自由基的产生与清除种起着重要作用，是防御氧化损伤的重要酶类[19]。蒋志胜等[20]α-三噻吩处理菜青虫(Pierisrapae) 后使超氧化物歧化酶失活，且有效抑制淡色库蚊(Culexpipienspallens) SOD、POD 和 CAT 比活力，使昆虫无法及时清除虫体产生的超氧阴离子等活性。本研究表明，苏云金亚种发酵液和发酵液滤液处理柳蚜后，其体内超氧化物歧化酶(SOD)活性6h与对照无显著差异，随胁迫时间的延长SOD比活力受到明显抑制，其12～24h抑制率达显著水平，30h恢复正常。柳蚜经发酵液和发酵液滤液处理过氧化氢酶(CAT)比活力均先升后降，除24h 外CAT比活力均高于对照，两处理对柳蚜CAT比活力总体呈激活作用，这与牛宇等[21]利用白僵菌(Beauveriabassiana)处理油松毛虫(Dendrolimustabulaeformis)幼虫后过氧化氢酶(CAT)活性变化趋势相似。苏云金亚种发酵液和滤液对柳蚜氧化物酶活性(POD)的激活速率存在差异，POD活力高峰分别出现在12h和18h，但两者对POD活性总体呈激活作用。由于苏云金亚种发酵液和发酵液滤液的胁迫，柳蚜体内的SOD、CAT和 POD的比活力均受到不同程度的影响，扰乱了自身的抗氧化作用，导致虫体内自由基的产生和清除之间失去了平衡，自身防卫能力下降。