Mn-SOD的提取及其应用研究进展

秦 松,何雨峰,况嘉铀,范淑敏,黄邵培,王伟平

(发酵工程教育部重点实验室,湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430068)

超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶,是良好的超氧阴离子自由基清除剂,能够催化细胞体内的超氧阴离子自由基,生成氧和过氧化氢。SOD主要存在于动物植物及微生物中[1]。根据其所含金属辅基的种类,可分为CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。Fe-SOD主要存在于原核细胞及一些植物中;CuZn-SOD主要存在于真核细胞细胞浆、叶绿体和过氧化物酶体内;而Mn-SOD主要存在于真核细胞线粒体和原核细胞内[2]。Mn-SOD是由约203个氨基酸残基构成的四面体,结构简单[3],其在原核生物中多为二聚体,在真核生物中多为四聚体,各亚基基本相同,每个亚基的相对分子质量一般为23 kDa,平均每个亚基含0.5～1个Mn原子。线粒体是细胞呼吸的主要场所,而氧化呼吸链的电子传递过程是机体形成自由基的重要方式之一。因此,位于线粒体内的Mn-SOD作为清除超氧阴离子的第一道防线,它在生物体内的表达和调控对于平衡机体的氧化还原稳态的维持起着十分重要的作用。近年来,关于Mn-SOD的研究不断深入,Mn-SOD的生理特性引起了人们的浓厚兴趣,与其相关研究也日趋活跃。本文就Mn-SOD的动植物以及微生物来源、基因工程菌生产及其应用进展进行综述。

1 Mn-SOD的提取

Mn-SOD是一种具有生物活性的酶,其本质是蛋白质。因此,Mn-SOD的生产提取本质是蛋白质的提取分离。然而,和一般蛋白质的提取相比,由于在细胞内含量很少,生产提取Mn-SOD较为复杂;同时,Mn-SOD作为具有生物活性的大分子物质,在提取纯化的过程中需要选取恰当的方法。

1.1 从动物中提取Mn-SOD

Mn-SOD在动物肝脏[4-5]、心脏[6]、肌肉[7]等中含量丰富。提取动物组织中Mn-SOD的普遍做法是以动物的肌肉、内脏为材料,进行机械匀浆,然后经过有机溶剂、盐类沉淀或层析柱分离得到Mn-SOD。

Mn-SOD首先是以无活性形式从鸡肝中分离得到的,当时被称为“禽锰素”[5]。随后,又从人肝中分离到该蛋白质,即Mn-SOD[4]。任美凤等[6]将鸡心用机器破碎成匀浆并进行抽提,用正丁醇除脂,然后丙酮分级沉淀,得到Mn-SOD。该酶的比活是1633 U/mg,纯化倍数139.16,全分子相对分子质量为103.7 kDa,其亚基相对分子质量23.6 kDa。Makoto Ikebuchi等[7]通过扇贝肌肉组织分离得到Mn-SOD,并测得扇贝Mn-SOD的相对分子质量约为93～95 kDa,其由四个相同的分子量约为24～25 kDa的亚基组成。姚翠鸾[8]将使用热处理、硫酸铵分级盐析和柱层析等方法,从日本沼虾肌肉组织分离得到Mn-SOD,其亚基分子量约为20 kDa。

以上可以看出,一般动物源所得到的Mn-SOD相对分子质量较大,约为100 kDa左右,且都具有分子量约为20 kDa的亚基。

1.2 从植物中提取Mn-SOD

从植物中分离Mn-SOD,一般是以植物的叶片为材料[9-12],经破胞沉淀得到均一Mn-SOD。除此之外,采用金属螯合亲和层析并结合离子交换层析同样可以得到Mn-SOD。

杨雄等[9]通过对韭菜线粒体进行硫酸铵沉淀经硫酸、柱层析和凝胶过滤,将韭菜线粒体SOD纯化到均一程度,得到韭菜Mn-SOD,分子量为82 kDa,由四个相同分子量约为22 kDa亚基组成,酶比活力达1200 U/mg蛋白。邹国林等[10]通过小白菜线粒体成功获取Mn-SOD,其亚基相对分子质量为21.8 kDa,酶比活力为1289 U/mg。赵晓瑜等[11]利用金属螯合亲和层析,结合DEAE-纤维素离子交换层析,从玉米匀浆液中分离纯化到电泳纯的Mn-SOD组分,通过双向电泳和SDS-PAGE分析表明,玉米Mn-SOD的亚基分子质量26.2 kDa,等电点为5.3。程光宇等[12]从朱桔叶分离得到Mn-SOD,分子量为54.0 kDa,该酶在SDS-PAGE图谱上呈现单一区带,其亚基分子量为26.6 kDa,酶比活性为1249 U/mg。饶丽莎等[13]采用qRT-PCR技术,分析杉木不同组织部位Mn-SOD基因的表达量差异发现,Mn-SOD在杉木叶片中表达较高,而根和茎表达量相对较低,这也为主要采用植物叶片作为原材料来提取植物Mn-SOD提供了依据。

可以看出,不同植物来源的Mn-SOD相对分子质量有所不同,但都具有亚基,酶活均为1300 U/mg左右。然而,一般而言,通常在植物组织中富含有机酸、维生素、微量元素及酚类和黄酮类物质,在提取Mn-SOD的过程中需要注意选择恰当的方法,避免酶活性的丧失。

1.3 从微生物中提取Mn-SOD

由于动植物的资源相对有限,工艺较为繁杂,为了得到大量的Mn-SOD,许多研究学者将Mn-SOD获取来源转向微生物。从微生物中分离Mn-SOD,以微生物菌体为材料,一般采用硫酸铵进行分级沉淀、柱层析以及离子交换的方法。

侯玉艳等[14]采用热击法和硫酸铵分级沉淀法对所提取的黑脉羊肚菌SOD进行纯化,对纯化后酶的热稳定性、pH稳定性、敏感性及同工酶类型等进行研究。该热击法最佳热击温度为60 ℃,最佳热击时间为15 min;而硫酸铵分级沉淀法最佳盐溶条件是采用40%饱和度硫酸铵,最佳盐析条件是采用85%饱和度硫酸铵,用邻苯三酚自氧化法检测酶活得到比活力为306.29 U/mg的Mn-SOD,且在60 ℃保温30 min仍能保留80%的酶活,在pH6～9的条件下仍能表现较高的酶活,具有很好的稳定性。武金霞等[15]采用硫酸铵分级盐析、离子交换柱层析、分子筛柱层析分离纯化,得到双孢蘑菇子实体Mn-SOD,其分子量为43 kDa,亚基分子量为21 kDa,邻苯三酚自氧化法检测酶活酶活高达5512.6 U/mg。可以看出,直接从微生物菌体分离得到Mn-SOD主要采用硫酸铵分级沉淀等方法。除此之外,陆玲等[16]以金针菇液体发酵菌丝为材料,用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳及抑制剂处理法,得到比活力为120 U/mL的Mn-SOD粗酶液,为分离提取MnSOD提供了一种新的方法思路。

以微生物为原材料较为廉价,相比动植物来源的Mn-SOD,由微生物中获取的Mn-SOD活性较高[15],且对外界环境有着良好的耐受性[14],在工业应用上前景较好。

1.4 利用基因工程菌提取Mn-SOD

近年来,随着科技发展,构建基因工程菌生产Mn-SOD已成为国内外的研究热点。利用基因工程菌提取Mn-SOD发展迅速,研究成果较多,该方法主要是首先通过PCR等方法获得动物[17-19]、植物[20-21]和微生物细胞[22-25]的Mn-SOD基因,然后构建重组质粒,转移至毕赤酵母、大肠杆菌或乳酸乳球菌等目标菌体中表达。利用基因工程菌产Mn-SOD具有产出快、产量高的优点,是动植物提取法所无法比拟的。

1.4.1 动物来源的Mn-SOD基因在细胞中的表达 直接从动物组织提取MnSOD,产率低、产出慢,因此不少学者利用基因工程手段,获得动物基因表达的Mn-SOD。张庆利等[17]采用PCR方法扩增编码中国明对虾线粒体Mn-SOD成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体中进行体外重组表达,将所得重组蛋白通过金属鳌合柱进行纯化,进而透析、复性,获得了活性高达2373 U/mg的重组蛋白。凌敏等[18]以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人Mn-SOD cDNA,构建重组质粒并转化至大肠杆菌BL21,获得了产Mn-SOD的重组蛋白菌株,其酶活达216.13 U/mg。而王峰等[19]以小鼠肝脏cDNA为模板,利用PCR方法克隆小鼠Mn-SOD基因,PCR扩增了1个长600 bp左右的基因片段,将其插入pET15b载体中,将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta-gami,获得Mn-SOD比活力为531.7 U/mg的工程菌。

可以发现,与直接从动物组织中获取MnSOD,通过重组动物来源的MnSOD基因在基因工程菌中表达得到的MnSOD,酶活较高[17],且能利用基因工程菌大量表达获取高产量的动物来源的Mn-SOD。

1.4.2 植物来源的Mn-SOD基因在细胞中的表达 由于提取植物中Mn-SOD工艺相对复杂,一些学者导入植物来源的Mn-SOD到基因工程菌中,通过基因工程菌表达提取植物源MnSOD。马红丹等[20]将克隆的大豆Mn-SOD基因开放阅读框序列重组到经改造的质粒pNZS上,分泌表达载体pNZS-SOD,以电穿孔法转化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,获得能够分泌表达外源Mn-SOD的基因工程菌。徐龙等[21]以茄子叶片cDNA为模板,扩增出带有SpeI和BglII酶切位点的ORF全长,然后分别用内切酶SpeI和BglII酶切扩增产物Mn-SOD基因和pCAMBIA 1302植物表达载体,回收酶切产物并用T4 DNA连接酶在4 ℃条件下连接6 h,获得转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,其所编码蛋白的分子量为25.63 kDa。

通常在植物组织中富含有机酸、维生素、微量元素及酚类和黄酮类物质,在提取Mn-SOD的过程中会导致酶活性的部分丧失。而通过重组植物来源的Mn-SOD基因在基因工程菌中表达提取Mn-SOD,能很好避免这一问题。

1.4.3 微生物来源的Mn-SOD基因在细胞中的表达 不仅是动物植物,一些研究者也对微生物Mn-SOD基因进行克隆表达。张丽青等[22]通过克隆嗜热毛壳菌锰超氧化物歧化酶基因,进行毕赤酵母真核表达,获得重组菌株,并纯化重组蛋白,该工程菌酶活力达906.23 U/mL;该重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH为6.0;在70 ℃的条件下保温30 min后仍具有71%的酶活力。赵怡[23]以枯草芽孢杆菌ATCC 9372基因组为模板,PCR扩增获得Mn-SOD基因,并在大肠杆菌BL21中首次成功表达。该研究得到的蛋白分子量约为26 kDa,菌体可溶性总蛋白SOD比活为51.09 U/mg。王黎明等[24]以蜡样芽孢杆菌M22的Mn-SOD基因构建了毕赤酵母表达质粒pPICZA-Mn-SOD,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GS115,得到高拷贝重组菌株,其表达蛋白的相对分子量约为23 kDa。邓盾等[25]从南海沉积物中分离到一株耐高温菌Bacillussp. SCSIO 15029,从其基因组中克隆了一个编码超氧化物歧化酶的基因BaSOD,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了可溶性异源表达,发现所表达的MnSOD的最适pH为7.5,最适反应温度为40 ℃,酶活为5511.46 U/mg,具有良好的热稳定性,在60 ℃处理30 min酶活基本没有变化,在70 ℃下处理30 min,剩余酶活为71%,具有较好的工业应用前景。

基因工程菌具有生长快、培养周期短的特点,其发酵产品具有高浓度、高转化率和高产率的优点。与直接从微生物中获取MnSOD,通过重组微生物来源的MnSOD基因,在基因工程菌中表达提取MnSOD,能有效地缩短MnSOD的产出时间,并提高MnSOD的产量。

2 Mn-SOD的应用

基于Mn-SOD良好的抗氧化和防御疾病等作用,近年来科学工作者在农业[13,26-27]和临床医学[28-39]上进行了广泛的应用研究。

2.1 Mn-SOD在农业上应用的研究

在农业上,研究发现Mn-SOD能够提高农作物的抗逆性,如抗寒、抗旱、抗盐害等特性。Bowler C等[26]通过转基因的方法,使烟草和玉米植株表达Mn-SOD水平提升,发现Mn-SOD在烟草和玉米叶绿体中的过量表达能够增强转基因烟草和玉米对质膜的保护作用和对除草剂引起的氧胁迫的耐受性;还有报道称,杉木在低温、干旱、铝、盐胁迫等逆境条件下均能快速诱导Mn-SOD的表达,并且分别在12、24、48 h达到峰值,且分别是对照组的47.94、3.29、22.21、33.88倍[13]。邓婷婷[27]用Mn-SOD基因的表达载体转染SOD缺陷型大肠杆菌并诱导其表达后发现该大肠杆菌在耐盐、耐辐射和抗寒方面的耐受性均有明显提高。这些研究发现为Mn-SOD在农业生产上的应用和发展提供了有利依据。

2.2 Mn-SOD在医学上应用研究

在医学上,Mn-SOD的应用研究成果颇丰。近年来,有报道称Mn-SOD在治疗高血压[28]、糖尿病视网膜病变[29]、抗辐射[30]、急性肺损伤[31]、癌症研究领域[32-38]等方面均有应用。

2.2.1 在治疗糖尿病上的应用 糖尿病和高血压被称为同源性疾病,两种疾病无论是病因、互相影响还是危害上都存在共通性,常常合并发作,形成糖尿病高血压。近年来有报道称,Mn-SOD能够在高血压和糖尿病视网膜病变的治疗中发挥作用。如Case等[28]研究发现,在大鼠穹窿下器官中过度表达Mn-SOD可显著降低血压,为Mn-SOD在高血压的临床治疗提供了新的思路。Kanwar等[29]研究发现,线粒体超氧化物歧化酶(Mn-SOD)能对糖尿病视网膜线粒体氧化损伤提供保护,该实验研究了超氧阴离子和GSH水平对糖尿病的影响,探讨锰超氧化物歧化酶在小鼠体内表达Mn-SOD和视网膜线粒体氧化应激反应,证实了糖尿病视网膜病变的发病与锰超氧化物歧化酶的相关作用。这些研究为Mn-SOD治疗糖尿病提供了新思路。

2.2.2 在癌症上的应用 Oberley[30]提出细胞癌变假设,认为正常细胞超氧阴离子生成与Mn-SOD活性保持动态平衡;其研究发现,Mn-SOD的活性与癌症的发生有着密切的关系。

2.2.2.1 在前列腺癌上的应用 王明臣等[31]分析了Mn-SOD基因在前列腺癌(PCa)及良性前列腺增生(BPH)组织中的mRNA表达情况,揭示了氧化应激损伤在PCa发生过程中的作用,证明了Mn-SOD基因表达低下导致的氧化应激加剧可能在前列腺癌的发生中起着重要作用。

2.2.2.2 在肾癌上的应用 在肾癌的研究领域,Zhao等[32]报道了应用数据依赖的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法对肾癌细胞(Rcc)进行氧化修饰,通过本体分类、相互作用网络和Western blotting分析表明,肾癌细胞介导的蛋白质与Mn-SODn密切相关。当Mn-SOD表达水平正常时,癌组织相对的Mn-SOD酶活性降低,提示肾癌组织中Mn-SOD酶活性因修饰而受损。同时,Zhao等[33]还对Mn-SOD在透明细胞癌(CcRCC)组织中的表达情况进行研究,研究结果显示透明细胞肾细胞癌中Mn-SOD mRNA的表达高于正常组织,且Mn-SOD蛋白的表达与正常肾细胞癌的表达呈负相关;并且发现,低Mn-SOD表达与肿瘤特异性生存预后较差有关。这些发现表明,MnSOD是肾透明细胞癌的一个有前景的预后指标,提示氧化应激可能参与了肿瘤的发生和发展。

2.2.2.3 在骨癌上的应用 楼列名等[34]探讨了锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因转染对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用,采用电穿孔方法将反义和正义Mn-SOD cDNA表达载体稳定转染OS-732骨肉瘤细胞,发现转染Mn-SOD质粒可诱导OS-732细胞凋亡,研究结果表明,Mn-SOD有望成为新的骨肉瘤细胞抑制剂。

2.2.2.4 在其他癌症上的应用 田刚等[35]利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的中插入Mn-SOD基因,构建出重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901;转染后发现,MnSOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞具有明显的杀伤作用。研究表明,MnSOD能够通过诱导细胞凋亡来产生抗癌作用的。此外,Zhang等[36]发现Mn-SOD表达对溶瘤腺病毒有抑制作用,Mn-SOD是结直肠癌患者最有效的辅助治疗。

2.2.3 在其他疾病研究上的应用 在其他的疾病防御上,研究表明Mn-SOD有着重要作用。例如,郭洪亮等[37]应用复制缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)作为锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和绿色荧光蛋白(GFP)基因载体转染小鼠小肠上皮实验,结果表明Mn-SOD的过度表达具有显著的放射性保护作用。Arcaroli等[38]发现,细胞外SOD是一种强有力的抗氧化剂,在控制氧化剂介导的应激和炎症中起着重要的作用,急性肺损伤在感染患者中经常发生,而在内毒素诱导的急性肺损伤动物模型中Mn-SOD水平对肺损伤的严重程度有明显的调节作用。

3 结语与展望

本文介绍了从动植物、微生物以及基因工程菌中分离获取Mn-SOD及其应用研究。Mn-SOD作为一种氧化还原酶,常存在于真核细胞的线粒体和原核生物中,最早获取Mn-SOD的方法就是主要是从动物的肌肉肝脏和植物的叶片中直接提取得到Mn-SOD。这类获取Mn-SOD的方法操作简单,工艺条件成熟,但是存在着产率较低和活性较低的缺点。而通过发酵培养微生物,得到大量菌体,再进行提取纯化,提取得到Mn-SOD产品,产出快,产量高,极好地克服了动植物直接提取法的缺点。

近几年,随着现代生物技术的快速发展,Mn-SOD已大多由原来的动植物提取过渡到基因工程技术来生产,产率与活性得到进一步提高。传统的Mn-SOD稳定性较差,很难在商品中长期保存。而利用基因工程菌得到耐热性较高的Mn-SOD,解决了其稳定性问题,也为今后Mn-SOD的开发提供了新思路。此外,国内外在Mn-SOD的应用等方面的研究报道颇多。尤其是在医学研究领域,其用于疾病机理的研究及诊断已成为当前的研究热点。这也表明,Mn-SOD在医学研究上有着其良好的特性。随着研究的深入,利用基因工程菌生产Mn-SOD逐步实现产业化,相信其在药品、食品等领域可以发挥巨大的潜力。