miRNA调控昆虫与病毒互作的研究进展

鲁 莎， 郭建洋， 席 羽， 万方浩,,*

1青岛农业大学植物医学学院，山东 青岛 266109； 2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193； 3中国农业科学院深圳农业基因组研究所，广东 深圳 518120

作为非编码RNA家族重要成员之一的miRNA是一类长度为18～25个碱基的小RNA分子，在基因的转录后调控中发挥重要作用，可以通过mRNA剪切或者抑制蛋白质翻译的方式负调控靶标基因(Florisetal.,2016; Kraussetal.,2018)。Leeetal. (1993)在秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans中发现了第一个miRNA：lin-4，负调控lin-14基因表达，使其在翻译水平上受到抑制。随后第二个miRNA分子let-7也在线虫中被成功鉴定，与lin-4调控机制相似(Reinhartetal.,2000)。此后被鉴定的miRNA的数量快速增长，截至2018年3月，在miRNA序列数据库miRBase (http:∥www.mirbase.org/)第22版中收录miRNA前体38589个，共计产生48885个成熟miRNA，涵盖了271个物种，其中包括33种昆虫、35种病毒；另有一专门针对病毒miRNA的数据库Vir-Mir (http:∥alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi)统计获得病毒miRNA前体30439个，其中双链DNA病毒(dsDNA)26339个，昆虫中主要存在的杆状病毒miRNA前体1683个。研究表明，miRNA可以调节大约50%的蛋白编码基因，参与包括生长发育、细胞分化、细胞凋亡、激素分泌等多种生理过程(Taftetal.,2010)，以及包括肺癌、结肠癌、病毒感染等多种病理过程(Gangaraju & Lin,2009; Katsushima & Kondo,2014)。

病毒是害虫生物防治中的一种主要防治措施，然而，随着病毒制剂的不断应用，昆虫与病毒之间相互作用、协同进化，昆虫发展出对病毒的抗性，而病毒也相应发展出应对这种抗性的对策。近年来，随着miRNA不断被发现，昆虫与病毒中产生的miRNA研究热度增大，其在两者互作中的调控作用也成为关注热点。宿主昆虫与病毒的基因组都能编码miRNA，这些miRNA能调控大量基因的表达。研究表明，病毒侵染后的昆虫，其体内的miRNA表达水平发生显著变化(Wuetal.,2013)，引起差异表达的原因可能是宿主自身产生的免疫应答反应，也可能是病毒感染所诱导的调控因子导致；另一方面，病毒编码的miRNA也可调控自身复制相关基因或直接作用于宿主免疫相关基因。本文从miRNA的生成、调控机制及其功能等方面综述miRNA的生物学特性，重点阐述其在昆虫和病毒互作中的调控作用，为害虫生物防治提供新的思路。

1 miRNA的生成机制

成熟miRNA的形成过程包括若干步骤：首先，编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ启动子的指导下被转录成初始miRNA(primitive miRNA, pri-miRNA)(Leeetal.,2004)。在细胞核内，pri-miRNA经RNaseⅢ家族的Drosha内切酶剪切后，形成带有茎环结构的长70～100 nt的前体miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)(Leeetal.,2003)，这一过程中Pasha蛋白作为辅助蛋白与Drosha形成复合体(Yeometal.,2006)。加工好的pre-miRNA再由转运蛋白Exportin-5从细胞核主动运输到细胞质中。Exportin-5可特异性识别经RNaseⅢ(Drosha)剪切后在3′末端有2个未配对核苷酸的pre-miRNA，并保护pre-miRNA从核内到胞质的完整性(Zeng & Cullen, 2004)。转运到细胞质中的pre-miRNA再进一步被Dicer(RNaseⅢ家族中专门消化双链RNA的酶分为dicer 1和dicer 2，将长链dsRNA剪切成约21 nt的短链dsRNA)及其辅助因子TRBP切割成18～25个核苷酸长度的双链miRNA:miRNA*分子。miRNA*双体中成熟miRNA链会选择性地整合到RISC(RNA induced silencing complex)中识别靶基因，通过与靶标mRNA的特定序列互补或不完全互补结合(Trujillordetal.,2010)，诱导靶标mRNA剪切或阻止其翻译，从而调控靶基因表达；另一条链miRNA*或许会快速降解(Leeetal.,2003)。还有一些来源和上述过程不同的miRNA，称为mirtron (Du & Zamore,2005; Ghildiyaletal.,2010)。mirtron由一些小的内含子经过剪接和去分支后，可不经过Drosha酶切而直接形成pre-miRNA，再进一步加工为成熟的miRNA (Yangetal.,2014)。

2 miRNA的调控机制

miRNA与RISC结合形成miRISC效应复合物后才能够调控靶标基因的表达。通常由miRNA的种子序列(5′第2～8位核苷酸)来识别靶基因，有2种机制来调控靶基因的表达：mRNA剪切和翻译抑制。miRNA与其靶基因的互补程度决定了它以何种机制沉默靶基因，当其与靶基因几乎完全互补时就会使mRNA降解；当其与靶基因不完全互补时则会引起mRNA的翻译抑制。尽管这个模型已被许多实验证实，但在后续的研究中发现了例外，拟南芥Arabidopsisthaliana(L.)中miRNA-172尽管与靶标基因APETALA2有近乎完全的碱基配对，却通过抑制靶标基因的翻译而行使功能(Chen,2004)；哺乳动物的miRNA-196与靶标基因HOXB8的3′端非翻译区(3′-UTR)几乎完全互补，却导致靶基因的降解(Kawasaki & Taira,2004)。而miRNA与靶标基因结合的位点也存在多种结合方式：早些时候认为miRNA的靶标位点位于靶基因的3′-UTR区，但Schnall-Levinetal. (2010)利用软件MinoTar (http:∥www.minotar.csail.mit.edu)预测并通过实验证实，在mRNA的编码区和5′-UTR区也有很多miRNA的结合位点。Lytleetal. (2007)研究发现，let-7不仅靶向3′-UTR，同时靶向5′-UTR。 miRNA对基因的表达调控是一个十分复杂的机制，往往不是一对一的对应关系，有可能一个靶基因由多个miRNA共同调控，也有可能一个miRNA调控多个靶基因表达(Legeaietal. 2010; Yuetal.,2007)。

3 miRNA的功能研究

从第一个miRNA发现至今，已经有数以万计的miRNA在不同的生物中被发现，miRNA在生物体中发挥的功能越来越引起人们的重视。目前对于其功能的研究主要还是通过基因突变或在miRNA的靶位点上引入突变来抑制miRNA的作用，通过观察生物体的表型变化来推测miRNA的功能，这是一种反向遗传学的研究方法(Jackson & Standart,2007)。另外一种推测miRNA功能的方法是对相应的miRNA进行过量表达。但是很多生物体的表型变化特征不明显，因而人们开始利用表达谱分析和生物信息学方法预测靶基因来研究其相对应的miRNA功能。

对已发现的一些miRNA的功能研究表明，miRNA几乎参与了生物体的整个生命过程，主要调控生理和病理2个方面。生理方面如细胞生长发育、组织分化、胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡及形态发生等。病理方面包括miRNA的异常表达会引起人类的各种疾病发生，如癌症、心血管紊乱、艾滋病、白血病、糖尿病等(Kloosterman & Plasterk,2006)。实验表明，miRNA在生物抵抗外界不良环境中起着十分重要的作用，miRNA的异常表达受环境压力的影响，当miRNA表达量变化时可以影响相应的靶基因表达，从而使生物体更好地适应环境改变(Lema & Cunningham,2010)。例如，当寄生蜂Glyptapantelesflavicoxis(Marsh)寄生舞毒蛾LymantriadisparL.后，舞毒蛾体内相关miRNA发生显著变化，从中发现miRNA对昆虫适应环境变化起到了积极的促进作用(Gundersen-Rindal & Pedroni,2010)。

4 miRNA在昆虫与病毒互作中的作用

4.1 病毒编码的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

目前，已确定300种能编码miRNA的病毒,这些病毒包括疱疹病毒、杆状病毒、腺病毒、多瘤病毒、囊泡病毒和主要侵染鳞翅目昆虫的Nudivirus(Belluttietal.,2015; Kozomara & Griffiths-Jones,2014； Liuetal.,2017; Singhetal.,2014)。miRNA已经在不同的杆状病毒如斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中被预测，其中一些已在实验中证实:Kharbandaetal. (2015)预测了48个新的SpltNPV编码的miRNA，其中10个在Sf21细胞中进行了验证;AcMNPV-miR-1被证实在AcMNPV感染的细胞中表达，调节靶标基因的表达以达到促进病毒自身感染的目的(Zhuetal.,2013,2016)。为了揭示由BmNPV编码的miRNA并阐明它们在BmNPV和宿主互作中产生的作用，Singhetal. (2010)通过检测中肠和脂肪体组织中病毒miRNA的表达谱报道了4种BmNPV编码的miRNA。其中一种miRNA：BmNPV-miR-3，可调节DNA结合蛋白的表达，在病毒侵染阶段发挥重要作用。BmNPV-miR-3在BmNPV侵染早期阶段表达，并对DNA结合蛋白进行负调控，使用锁核酸技术(locked nucleic acid,LNA)抑制BmNPV-miR-3的表达后，DNA结合蛋白的表达量增加，同时病毒量增加，而过表达BmNPV-miR-3则导致其表达量减少，病毒量也相应减少。

随着对miRNA的深入研究，病毒来源的miRNA在调节病毒—宿主互作中发挥的重要作用被更多发现。病毒miRNA可直接改变宿主生理机制，干扰宿主与病毒互作中的宿主防御机制。一些病毒miRNA，如KUN-miR-1和OvHV-2-miR-5直接与昆虫宿主靶标基因相互作用，直接调控病毒感染和病毒复制(Hussainetal.,2012; Riazetal.,2014; Wuetal.,2016)。BmNPV-miR-1通过调节输出蛋白-5辅因子Ran来抑制其宿主miRNA的表达，从而导致病毒增殖增强(Singhetal.,2012)。AcMNPV-miR-1是一种由AcMNPV编码的miRNA，其碱基序列与病毒基因ODV-E25的编码区完全匹配，通过下调ODV-E25 mRNA的表达削弱病毒的产生(Zhuetal.,2013)。Zhuetal. (2016)将Ac18和Ac95鉴定为AcMNPVmiR-1的2个新靶点，尽管AcMNPV-miR-1与ac18和ac95显示不完全匹配，但它可同时调节它们的表达，总之，ac18的轻度表达和ac95的下调表达意味着AcMNPV-miR-1通过上调Ac18同时下调Ac95来抑制细胞感染和病毒复制。基于上述报道，可以认为病毒miRNA可能靶向大量细胞转录物和病毒，利用miRNA作为调节细胞环境的有效手段，构建病毒适宜生长的内部环境。

4.2 昆虫编码的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

研究表明，病毒感染可诱导宿主miRNA表达谱的变化。miRNA微芯片测序结果表明，棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)感染棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)后脂肪体内有127个差异表达的宿主miRNA(张松斗,2017)。埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)感染登革热病毒(DENV)会改变miRNA表达谱，在感染后第9天，23种miRNA表达量发生变化(Campbelletal.,2014)。白纹伊蚊AedesalbopictusSkuse感染DENV病毒后，miR-252在血淋巴中表达增加，并且抑制此miRNA导致病毒拷贝增加，而miRNA的过表达则抑制病毒繁殖(Yanetal.,2014)。埃及伊蚊感染ZIKV(一种主要由埃及伊蚊传播的黄病毒)时，感染组织与未感染组织相比较，其17种miRNA表达量发生变化，其中aae-miR-2940-3p和aae-miR-1-5p明显上调表达(Saldaaetal.,2017)。感染BmCPV的家蚕BombyxmoriL.和正常家蚕比较，有58个miRNA表达差异显著，10个差异表达的miRNA通过qRT-PCR方法进一步被证实(施莉莉,2016)，它们在病毒感染后表达水平的改变意味着可能在病毒—宿主互作中起作用。而杆状病毒感染时sfrmiR-184下调4种不同基因的表达(Mehrabadietal.，2013)。斜纹夜蛾Prodenialitura(Fabricius)幼虫受到杆状病毒感染后，大多数宿主miRNA表达水平下降，但在Sf9细胞中的miRNA、Bantam增加(Shietal.,2016)。

有些种类的病毒能够利用宿主细胞的miRNA促进自身复制(Joplingetal.,2005)，而其他的一些宿主miRNA却能阻止病毒增殖(Sanghvi & Steel,2012)。Wolbachia能够利用埃及伊蚊miRNA调控宿主的基因(如metalloprotease、MCTl、MCM6和methyltransferase)表达来抑制登革热病毒的复制或促进自身增殖(Osei-Amoetal.,2012)。当白纹伊蚊感染登DENV后，miR-252表达增加，并且当加入此miRNA抑制剂时导致病毒复制，而加入类似物时抑制病毒复制，推断miR-252对DENV的复制侵染具有抑制作用(Yanetal.,2014)。HaSNPV能够操纵棉铃虫miR-14下调Ha-ECR基因的表达，从而调节宿主幼虫的生长发育以促进自身的复制(Jayachandranetal.,2013)。谷实夜蛾Helicoverpazea(Boddie)中的Hz-miR-24负调控编码DNA依赖性RNA聚合酶家族的HvAV-3e的转录物DdRP和DdRPβ，从而对病毒复制起到调控作用(Hussain & Asgari，2010)。

5 总结与展望

miRNA的发现让研究者对基因转录后调控机制的理解又进了一层。有关在昆虫免疫方面起作用的miRNA报道极少，Kayvanetal. (2013)证实小菜蛾PlutellaxylostellaL. miR-8正向调节丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin27的转录水平，serpin27调节Toll途径的激活和参与昆虫黑化反应的酚氧化酶，在被半闭弯尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen寄生后，miR-8表达水平降低，导致serpin27转录水平显著下降，作为宿主免疫应答的一部分，miR-8及其靶标基因serpin27在寄生后下调表达来激活宿主免疫系统。Yuanetal. (2017)报道了serpin-5和serpin-9在棉铃虫感染杆状病毒后上调表达，抑制黑化反应，降低棉铃虫的存活率。棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)是近几十年来越来越多地被用作害虫防治的生物杀虫剂，在杆状病毒杀死害虫之前，它必须侵入并躲避宿主的免疫反应。

越来越多的昆虫或病毒的miRNA被发现和鉴定出来，miRNA在昆虫宿主与病毒互作中调控作用的研究也成为热点。昆虫miRNA能够调控靶标基因抑制病毒在其体内的大量复制增殖，而病毒miRNA则利用宿主miRNA或自身产生的miRNA提高自身的增殖能力，从miRNA的角度揭示了昆虫与病毒之间的相互作用影响与协同进化关系。进一步探索miRNA在昆虫与病毒互作中的调控作用，可以为害虫生物防治提供新思路与新方法；研究miRNA在昆虫—病毒中的作用机制，可以为病毒制剂的研发提供理论基础。