化浊抗纤保肝汤对肝炎后肝纤维化大鼠肝纤维化的影响及机制

李瑞东 王力军

(邢台医学高等专科学校第二附属医院内科，河北 邢台 054000)

世界卫生组织统计显示，每年肝病患者死亡的人数约100万，其中有3%～6%的人会发展成为肝癌〔1,2〕。肝纤维化是一种发生于肝脏的炎症反应，主要由肝炎病毒、血吸虫病、酒精、药物及毒物等长期持续损害肝脏，引起肝脏结缔组织过度增生及异常沉积，最终引起肝脏正常结构发生病理变化和肝功能障碍〔3〕。肝纤维化的病理变化过程是可以预防和阻断的。因此，如何预防、治疗及逆转肝纤维化进程是肝病研究领域的热点之一。目前，肝纤维化常用西药和中药进行治疗，但西药特异性较差，中药的治疗效果较好，具有较好的应用前景，但其作用机制尚不完全清楚〔4,5〕。化浊抗纤保肝汤具有解毒化浊、清热利湿、益气扶正、养血生血的功效，对肝纤维化的发展具有重要作用。本研究通过制备肝纤维化大鼠模型，分析化浊抗纤保肝汤对其肝功能和肝纤维化指标的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD雄性大鼠购自河北医科大学动物实验中心，体重110～130 g，单独饲喂于室温20～22℃、相对湿度60%的环境中，自由采食和饮水。

1.2实验试剂 化浊抗纤保肝汤由黄芪、黄连、红景天、三棱、田基黄、茵陈、绞股蓝、鳖甲、虎杖等组成。方剂水煎将生药浓缩至1.5 g/ml。逆转录试剂盒、PCR mix 购自北京康为世纪有限公司，Bcl-2兔抗鼠单克隆抗体、Bax兔抗鼠单克隆抗体、增殖细胞核抗原Ki-67兔抗鼠单克隆抗体购自美国Sigma公司；二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；透明质酸酶(HA)放射免疫试剂盒、层黏连蛋白(LN)放射免疫试剂盒购自北京海研医学生物技术中心。

1.3实验方法

1.3.1实验分组 健康SD大鼠随机分为对照组、模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组，每组10只。

1.3.2造模及给药处理 模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组大鼠给予未经灭活的猪血清按0.5 ml/kg经腹腔注射，每周2次，连续6 w。同时模型组、保肝汤1组按0.5 ml·kg-1·d-1给予蒸馏水、化浊抗纤保肝汤浓缩剂灌胃，持续给药至第9周；保肝汤2组、保肝汤3组分别在造模第3周和第6周按0.5 ml·kg-1·d-1给予化浊抗纤保肝汤浓缩剂持续给药至第9周。对照组按0.5 ml/只经腹腔注射生理盐水，每周2次，连续6 w，同时经灌胃给予蒸馏水至第9周。

1.3.3肝功能指标的检测 实验结束前24 h，各组大鼠禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹经下腔静脉采血，分离血清，全自动生化分析仪分析肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平。

1.3.4肝纤维化的检测 实验结束前24 h，各组大鼠禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹经下腔静脉采血，放射法检测HA、LN指标。

1.3.5细胞增殖与凋亡相关基因的检测 采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA的水平。利用Primer5.0软件设计Bcl-2、Bax、Ki-67引物序列，由上海生物工程有限公司合成，Bcl-2上游序列为5′-CCGAGAGGTCTTCTTCCGTGTG-3′，下游序列为5′-GCCTCAGCCCATCTTCTTCCA-3′，Bax上游序列为5′-CAAGCCGGGAGAACAGGGTA-3′，下游序列为5′-CCCACCGAACTCAAAGAAGGC-3′。Ki-67上游序列为5′-GGACTCGCAGTTTGAGAAGG-3′，下游序列为5′-TGCAAATGTCC TCGTTTCTG-3′。100 mg肝组织加入1 ml TRIzol裂解液提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，GAPDH为参照，进行扩增。反应体系为25 μl，反应条件为预变性94℃ 90 s，变性94℃ 30 s，退火58℃/57℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，终延伸72℃ 5 min，35个循环。实验重复3次，结果经凝胶成像分析仪进行分析，与GAPDH产物扫描量的比值为目的基因的相对表达量。

1.3.6细胞增殖与凋亡相关蛋白的检测 Western印迹法检测肝组织中Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平。取出肝组织100 mg，加入500 μl预冷的蛋白裂解液，冰浴中超声震碎，12 000 r/min离心1 h，收集上清。调整蛋白浓度，取100 μl样本蛋白按1∶1的比例加入2倍样品缓冲液，100℃加热5 min。清洗玻璃板，配置10%的分离胶和4%的浓缩胶，将分离胶加入玻璃板，加入去离子水，静置至完全聚合，加入浓缩胶，插入样品梳。加样，浓缩胶75 V电泳，分离胶120 V电泳。200 mA将蛋白转至大小适中的硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜放入5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入5%脱脂牛奶稀释的一抗溶液，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次×5 min，加入TBST稀释二抗，37℃孵育30 min，TBST漂洗3次×5 min，加入电化学发光(ECL)反应液，曝光，显影、定影，凝胶成像系统记录蛋白质的灰度值，并进行分析。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组肝功能指标比较 模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组大鼠血清ALT、AST的水平均显著高于对照组；保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组血清ALT、AST的水平均显著低于模型组；保肝汤2组、保肝汤3组较保肝汤1组血清ALT、AST水平显著升高；保肝汤3组较保肝汤2组血清ALT、AST水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2各组肝纤维化指标比较 模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组血清肝纤维化指标HA、LN水平均显著高于对照组；保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组血清HA、LN的水平均显著低于模型组；保肝汤2组、保肝汤3组较保肝汤1组血清HA、LN水平显著升高；保肝汤3组较保肝汤2组血清HA、LN水平显著升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表1 各组肝功能指标水平比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与保肝汤1组比较：3)P<0.01；与保肝汤2组比较：4)P<0.01，下表同

表2 各组肝纤维化指标水平比较

2.3各组细胞增殖与凋亡相关基因mRNA水平比较 模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组肝组织Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA水平均显著高于对照组；保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组肝组织Bcl-2、Ki-67 mRNA水平均显著高于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)，Bax mRNA水平与模型组差异无统计学意义(P>0.05)；保肝汤2组、保肝汤3组较保肝汤1组血清Bcl-2、Ki-67mRNA水平显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，Bax mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；保肝汤3组较保肝汤2组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组细胞增殖与凋亡相关基因mRNA水平比较

2.4各组细胞增殖与凋亡相关基因蛋白水平比较 模型组、保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组肝组织Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平均显著高于对照组；保肝汤1组、保肝汤2组、保肝汤3组肝组织Bcl-2、Ki-67蛋白水平均显著高于模型组差异均有统计学意义(均P<0.05)，Bax蛋白水平与模型组差异无统计学意义(均P>0.05)；保肝汤2组、保肝汤3组较保肝汤1组肝组织Bcl-2、Ki-67蛋白水平显著降低差异均有统计学意义(均P<0.05)，Bax水平差异无统计学意义(均P>0.05)；保肝汤3组较保肝汤2组差异无统计学意义(均P>0.05)。见图1和表4。

图1 各组肝组织Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平比较

组别Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHKi-67/GAPDH对照组0.351±0.0450.343±0.0420.532±0.067模型组0.463±0.0251)0.722±0.0581)0.863±0.0691)保肝汤1组0.859±0.0331)2)0.718±0.0851)1.863±0.2591)2)保肝汤2组0.693±0.0711)2)3)0.698±0.0911)1.332±0.1751)2)3)保肝汤3组0.688±0.0971)2)3)0.713±0.0851)1.247±0.2631)2)3)F值112.47249.22271.943P值0.0000.0000.000

3 讨 论

肝纤维化是由多种因素引起的慢性肝炎反应，可诱导产生多种慢性肝病，也是肝硬化的必经途径〔6〕。猪血诱导制备大鼠肝纤维化模型，其肝脏病理改变与人临床肝纤维化症状相似，是研究肝纤维化常用的动物模型。目前，ALT、AST是国内外肝功能损害的常用检测标准〔7〕。ALT主要存在于细胞质，AST在肝细胞线粒体内的含量较高，在急性肝损伤中常用ALT为指标，但AST的含量反映肝细胞的损伤程度〔8〕。当发生慢性肝炎等疾病时，肝细胞膜的损伤较为严重，线粒体则基本完整，ALT穿过细胞质进入血液；肝细胞线粒体受损严重时，则导致大量AST进入血液〔9〕。因此，在肝功能异常时，血清中ALT、AST的水平反映肝功能的受损程度。肝纤维化发生时，HA随着肝纤维化的程度而逐渐升高；当肝纤维化程度减弱时，HA的水平之间下降〔10〕。因此常用血清中HA的含量作为肝纤维化发生、发展的指标。LN是基底膜透明层的主要成分，与肝组织的病理变化有显著相关性，其血清中的含量常被用来检测肝纤维增生的敏感指标〔11〕。本研究结果提示化浊抗纤保肝汤具有缓解肝纤维化的作用，且作用越早效果越佳，与前期的研究结果一致〔12〕。肝纤维化由多种原因产生，人们认为细胞的增殖与凋亡是预防和治疗肝纤维化的重要因素之一〔13，14〕。细胞的凋亡过程由多种基因进行调控，是一个复杂的过程。其中Bcl-2家族被认为与细胞的凋亡过程密切相关。Bcl-2通过调控细胞色素C与凋亡相关因子的分泌，调节细胞的凋亡过程。Bax可与Bcl-2形成异源二聚体参与细胞的凋亡过程。研究表明，当Bax的表达量增加可促进细胞凋亡的发生〔15〕。当Bcl-2过表达，形成异源二聚体的反应增加，降低游离状态Bax的水平，抑制细胞的凋亡；当Bax过表达，形成同源二聚体的反应增加，发挥促凋亡的作用。Ki-67分布于细胞周期除G0期以外的其他任何时期，具有半衰期短的特点，在细胞完成有丝分裂后快速降解和失去抗原决定簇，因此常被用来反映细胞增殖活性的敏感指标〔16〕。本研究结果表明化浊抗纤保肝汤参与肝纤维化的发生、发展，主要通过促进肝细胞的增殖，诱导其凋亡。