BMSCs与VEGF结合藻酸钙支架治疗兔早期股骨头坏死的疗效

季庆辉 乔建民 薛宇 刘士臣 乔晓峰 姬宇辉 李恒威

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目前糖皮质激素是导致股骨头缺血性坏死第二因素，患病率可高达38%〔1〕。而且激素可导致骨髓间充质干细胞(BMSCs)的活性减退，因此BMSCs和激素性骨头坏死有一定的相关性，目前对股骨头坏死没有有效的手段。本研究髓芯减压兔早期股骨头坏死模型，把BMSCs和血管内皮生长因子(VEGF)结合藻酸钙支架移植到减压区，观察坏死区的变化。

1 材料与方法

1.1一般资料 60只3.0 kg新西兰大白兔4～5月龄，保存在一个温控房间(23℃)随意提供食物和水。本研究经当地动物伦理委员会同意，并按照佳木斯大学动物保护和动物实验管理法律执行实施。

1.1.1激素性股骨头坏死模型制备〔2〕首先按1 kg兔子注射脂多糖10 μg的剂量经兔耳缘静脉注射，1 d后在臀部肌肉注射甲泼尼龙，按每1 kg体重注射20 mg的剂量注射，共3 d，6 w后选出成功的模型。最终除去死亡和失败模型，共剩54只。将其随机分成激素性股骨头坏死组(A组)；单纯减压组(B组)；减压后植入BMSCs(C组)；减压后植入BMSCs及VEGF(D组)；减压+带有BMSCs的藻酸钙支架(E组)；减压后+带有VEGF、 BMSCs的藻酸钙支架(F组)，各9只。

1.1.2兔骨BMSCs分离培养 按Pittenger等〔3〕方法，取自新西兰兔自体，耳缘静脉注射戊巴比妥麻醉后，用碘伏消毒髂骨处，用骨髓穿刺针穿刺，抽取骨髓共约5 ml；用吸管进行吹打，制成细胞悬液，采用密度梯度离心，2 000 r/min离心20 min后用吸管取中层有核细胞层，再将其接种于细胞培养皿中培养。

1.1.3藻酸钙支架的制备〔4〕将102mmol/L CaCl2溶液和1.2%藻酸钠溶液用2 000 r/min祸旋混合器横拌，快速充分混合15 s。混合后的溶液放入球型模具中塑型10 min制成三维支架。pH值调为7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃备用。

1.2实验方法 用陆眠宁0.2 ml·kg-1·BW-1将兔麻醉后，取仰卧位，穿刺部位备皮、消毒，铺巾。切开后，在X线下用电钻钻入股骨头中心部位。

1.3观察指标 (1)进行对BMSCs的生长观察；(2)病理组织学观察：每组切片行苏木素-伊红(HE)染色，通过观察骨陷窝和血管数目了解股骨头坏死区域的修复情况；(3)股骨头X线检查：4、8 w检测待兔麻醉后，仰卧于X线检查桌上，将髋关节置于中心，观察股骨头区变化情况。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1BMSCs的生长观察结果 如图1所示，培养5 d后，可见大量BMSCs贴壁生长。传代3～7 d后，指数生长，倍增时间为4 d。

图1 BMSCs的生长观察(×200)

2.2组织学观察 股骨头组织切片HE染色显示，A组4 w时可见骨陷窝增加，骨小梁不规则、破坏。8 w时股骨头软骨面破坏与修复并存，软骨面塌陷；B组8 w时在减压边缘形成少量的新生骨小梁；其余各组在4 w时缺损处内有少量新生血管和类骨细胞生成；8 w标本减压区D组中部分标本可见血管形成，而C、E组缺少新生血管；F组8 w标本坏死减压区有大量新生血管及成骨细胞，可见骨小梁排列有序。见图2。

2.3各组空骨陷窝数、血管计数 F组4、8 w骨陷窝阳性数与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)；血管数目数除与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图2 8 w时股骨头坏死区HE染色结果(×200)

组别空骨陷窝计数4 w8 w血管计数4 w8 wA组25.50±1.282)25.33±1.272)3.53±1.272)3.07±1.072)B组22.19±1.392)20.07±1.372)4.61±1.182)4.90±1.512)C组19.67±1.172)17.33±0.822)5.33±1.032)6.97±0.31D组14.33±1.031)2)8.13±0.822)7.98±1.291)9.53±0.531)E组13.24±1.231)2)9.47±1.312)5.07±1.312)6.50±1.05F组10.33±1.211)6.17±0.417.17±1.171)9.50±1.381)

与同组8 w比较：1)P<0.05；与F组比较：2)P<0.05

2.4坏死股骨头X线检查 A组4 w时股骨头密度减低，骨小梁正常结构消失；8 w时软骨下骨破坏。B组减压区术后4、8 w减压区内密度无明显改变，剩下各组减压区术后4 w时密度低，C、D、E组8 w时出现稀疏骨小梁，而8 w时F组可见较密的骨小梁。

3 讨 论

对早期坏死股骨头不治疗，关节面就会塌陷，坏死的股骨头与髋臼粘连，最终要进行髋关节置换〔5〕。但髋关节置换术后10～20年后需再次置换，因此需要找一种新的方法来治疗股骨头坏死，干细胞移植治疗早期股骨头坏死是近年研究中的热点〔6〕。本实验发现在激素股骨头坏死区有相对较多血管，有相关研究也证实VEGF可以促进毛细血管长入骨修复区，而VEGF不能直接促进BMSCs生成血管内皮细胞，进而形成血管〔7〕。Zhang等〔8〕研究发现，髓芯减压后，骨形成蛋白(BMP)和人VEGF通过腺相关病毒载体注入激素诱导兔早期ONFH病灶区，增强了坏死股骨头的修复能力。有研究证实BMP和VEGF促进BMSCs生成骨的能力比单独BMP促进BMSCs生成骨的能力强，因此可说明VEGF可以促进BMSCs生成骨细胞〔9〕，与实验结果相同。

藻酸钙支架具有三维立体多孔结构〔10〕，为BMSCs生成骨细胞修复坏死股骨头区提供理想支架；能够分泌钙离子，从而促进BMSCs生成骨细胞的能力，与本实验结果一致。VEGF和藻酸钙支架两者都有促进BMSCs生成骨细胞的作用，将会共同对早期股骨头坏死区BMSCs起作用来生成新骨，因此本实验结果F组股骨头坏死区修复的最为理想。

自体BMSCs与VEGF结合藻酸钙凝胶修复激素性股骨头坏死疗效可靠，VEGF不但促进新生血管形成，而且加速骨的生长，并且藻酸钙支架释放钙离子促进BMSCs的成骨，此治疗方案可为治疗早期股骨头坏死提供理论基础。